Complexation d'un fragment de brin télomérique riche en C par des protéines de Saccharomyces cerevisiae. Identification génomique aux IMPDH. Possible repliement en motif i de l'ADN complexé. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2000

Complexation d'un fragment de brin télomérique riche en C par des protéines de Saccharomyces cerevisiae. Identification génomique aux IMPDH. Possible repliement en motif i de l'ADN complexé.

Résumé

The final areas (telomere) of the chromosomes of the majority of the organizations are essential with the maintenance and the integrity at the end of the chromosomes and are implied in the cancerogenesis and cellular ageing. The telomeres are formed by one rich strand in guanines and one strand rich in cytosines. In vitro, each strand is organized in a folded up structure, quadruplexe of guanine for one, and the i-motif for the other, which raises the question of the biological role of these structures. Several proteins bind to the G strand and supporting the formation of guanine quadruplexes are known. Two proteins specifically recognizing the C strand of human telomeric DNA were identified (ASF/SF2 and hnRNP K). We wanted to contribute to the comprehension of the mechanisms of regulation of the telomeres by seeking a protein specifically binding to a sequence telomeric DNA rich in cytosine. This study was undertaken on an organization eucaryote, the yeast Saccharomyces cerevisiae. We started by showing that the fragment telomeric DNA of yeast, d[(CCCACA)3CCC], could form an i-motif in vitro. We observed by nondenaturing electrophoretic migration, the formation one complex DNA-protein on which we focused our efforts. The molecular mass of this protein (~ 250 kDa) was determined by gel filtration chromatography. The association DNA-protein was observed for a range of pH from 6 to 8. One duplexes ADN B d(CGCGATCGCG) or one small continuation of cytosines d(CCC) are not candidates and the delayed signal is attenuated of half for a report/ratio monobrin d(T14)/probe of 4000. The ADN of E coli, crossed in fragments from 10 to 1000 bases, is candidate (50%) for a competitor/probe ratio equal to 1000. But all oligomer sequences tested in vitro formant an i-motif monomeric (sequences with 4 repetitions of 2, 3, 4 or 5 of deoxycytidines, of which telomeric or centromeric sequences natural), enter in competition with the sequence d[(CCCACA)3CCC], in particular under conditions (pH, temperature, ionic force,..), where the i-motif is observed in vitro. To identify proteins implied in association with a telomeric DNA, we used streptavidin grafted or not with the DNA sequence. We identified proteins related to DNA by mass spectrometry Maldi-tof and Q-tof MS/MS. It seems to be three proteins Yhr216p, Ylr432p and Yml056p, to which the sequences are very close. This identification was confirmed by sequencing by Edman degradation of internal peptides. The sequences of these proteins are similar (~ 78 %) with the two inosine 5'-monophosphate dehydrogenases human (IMPDH 1 and 2 (mass of ~ 56 kDa)) known for their implication in the metabolism of purins. Those are usually observed in tetrameric form (mass > 200 kDa). In spite of the presence in human nuclear extracts HeLa of one protein having native characteristics of migration identical to those observed at yeast, and different from already identified proteins ASF/SF2 and hnRNP K, we showed that proteins IMPDH 1 and 2 purified are not able to only fix human telomeric DNA. We also show that the identified proteins (Yhr216p, Ylr432p and Yml056p) bound with the complementary strand rich in G during electrophoretic migrations in the presence of candidates and show that this association is specific. To our knowledge, it seems to be the first telomeric yeast proteins interacting separately with each of the two bits under incubating conditions where we observed the formation of quadruplexes of guanines and I-motif.
Les régions terminales (les télomères) des chromosomes de la plupart des organismes sont
essentielles au maintien de l'intégrité des chromosomes et sont impliquées dans la cancérogenèse et
le vieillissement cellulaire. Les télomères sont formés d'un brin riche en guanines et d'un brin
complémentaire riche en cytosines. In vitro, chaque brin s'organise en une structure repliée, le
quadruplexe de guanines pour l'un, le motif i pour l'autre, ce qui pose la question du rôle
biologique de ces structures. Plusieurs protéines s'associant au brin G et favorisant la formation de
quadruplexes de guanines sont connues. Deux protéines reconnaissant spécifiquement le brin C de
l'ADN télomérique humain viennent d'être identifiées (ASF/SF2 et hnRNP K).
Nous avons voulu contribuer à la compréhension des mécanismes de régulation des
télomères en recherchant une protéine se liant spécifiquement à une séquence d'ADN télomérique
riche en cytosines. Cette étude a été entreprise sur un organisme eucaryote, la levure
Saccharomyces cerevisiae.
Nous avons commencé par montrer que le fragment d'ADN télomérique de levure,
d[(CCCACA)3CCC], pouvait former un motif i in vitro. Nous avons observé par migration
électrophorétique non dénaturante, la formation d'un complexe ADN-protéine sur lequel nous
avons focalisé nos efforts. La masse moléculaire de cette protéine (~ 250 kDa) a été déterminée par
passage sur tamis moléculaire. L'association ADN-protéine a été observée pour une gamme de pH
allant de 6 à 8. Un duplexe d'ADN B d(CGCGATCGCG) ou une petite suite de cytosines d(CCC)
ne sont pas compétiteurs et le signal retardé est atténué de moitié pour un rapport monobrin
d(T14)/sonde de 4000. L'ADN d'E. coli, coupé en fragments de 10 à 1000 bases, est compétiteur
(50%) pour un rapport compétiteur/sonde égal à 1000. Mais toutes les séquences d'oligomères
testées formant in vitro un motif i monomérique (séquences comptant 4 répétitions de 2, 3, 4 ou 5
de désoxycytidines, dont des séquences télomériques ou centromériques naturelles), entrent en
compétition avec la séquence d[(CCCACA)3CCC], notamment dans des conditions (pH,
température, force ionique,..), où le motif i est observé in vitro.
Pour identifier les protéines impliquées dans l'association avec l'ADN télomérique, nous
avons utilisé des billes de streptavidine greffées ou non avec la séquence d'ADN. Nous avons
identifié les protéines liées à l'ADN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et Q-TOF MS/MS. Il
s'agit de trois protéines Yhr216p, Ylr432p et Yml056p, dont les séquences sont très proches. Cette
identification a été confirmée par séquençage par dégradation d'Edman de peptides internes. Les
séquences de ces protéines sont similaires (~ 78 %) aux deux inosine 5'-monophosphate
déshydrogénases humaines (IMPDH 1 et 2 (masse de ~ 56 kDa)) connues pour leur implication
dans le métabolisme des purines. Celles-ci sont habituellement observées sous forme tétramérique
(masse > 200 kDa). Malgré la présence dans des extraits nucléaires humains HeLa d'une protéine
ayant des caractéristiques de migration natives identiques à celles observées chez la levure, et
différentes des protéines ASF/SF2 et hnRNP K déjà identifiées, nous avons montré que les
protéines IMPDH 1 et 2 purifiées ne sont pas capables de fixer seules l'ADN télomérique humain.
Nous montrons également que les protéines identifiées (Yhr216p, Ylr432p et Yml056p)
s'associent au brin complémentaire riche en G. Des migrations électrophorétiques en présence de
compétiteurs montrent que cette association est spécifique. A notre connaissance, il s'agit des
premières protéines de levures interagissant séparément avec chacun des deux brins télomériques
dans des conditions d'incubation où l'on observe la formation de quadruplexes de guanines et de
motif i.
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Dates et versions

tel-00003611 , version 1 (21-10-2003)

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  • HAL Id : tel-00003611 , version 1

Citer

Jean-François Cornuel. Complexation d'un fragment de brin télomérique riche en C par des protéines de Saccharomyces cerevisiae. Identification génomique aux IMPDH. Possible repliement en motif i de l'ADN complexé.. Biochimie [q-bio.BM]. Ecole Polytechnique X, 2000. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00003611⟩
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