De la caractérisation génétique et phénotypique de Cryptosporidium (Alveolata : Apicomplexa) à la mise en évidence du rôle de C. parvum dans l'induction de néoplasie digestive - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2008

From the genetic and phenotypic characterisation of Cryptosporidium (Alveolata : Apicomplexa) to the evidence of the role of C. parvum in the induction of digestive neoplasia

De la caractérisation génétique et phénotypique de Cryptosporidium (Alveolata : Apicomplexa) à la mise en évidence du rôle de C. parvum dans l'induction de néoplasie digestive

Gabriela Certad
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 855525

Résumé

Cryptosporidiosis represents a major public health problem. This infection, caused by protozoa of the genus Cryptosporidium, has been reported worldwide as a frequent cause of diarrhoea, and its prevalence varies according to different regions. In developed countries, massive Cryptosporidium foodborne and waterborne outbreaks have been reported. In developing countries, Cryptosporidium affects mostly children under five. Furthermore, cryptosporidiosis remains a clinically significant opportunistic infection in immunocompromised patients, causing potentially life-threatening diarrhoea, especially in those HIV-infected persons. Additionally, these parasites not only infect humans, but also cause morbidity in farm animals. The parasite begins its life cycle as sporulated oocysts which enter the environment through the feces of the infected host. The infective oocysts reside in food and water. Most transmission occurs through recreational water use. Cryptosporidium has also entered drinking water supplies, causing major outbreaks in cities around the world. Infection occurs when the oocysts are ingested by a suitable host. Without medical prescription, Cryptosporidium detection is not done as a routine, and the observation of the morphology of the parasite is not enough to establish differences between species. For that reason molecular techniques have been developed to differentiate this parasite at the species and genotype levels, and several methods have been used to study and characterize different parasite strains.
Because the knowledge about molecular epidemiology is important to the better understanding of the parasite infection, in the first part of this work we characterized the genetic variability of species and subspecies of Cryptosporidium in different regions: Venezuela, Francia, Haiti et Iran.
A cross-sectional study was undertaken to determine the prevalence of cryptosporidiosis and its clinical and laboratory pattern in Venezuelan HIV-infected patients. At enrollment, they underwent thorough clinical history and physical examination and provided stool specimens for the identification of Cryptosporidium sp. and other parasites. Cryptosporidium sp. was identified in 15%. This infection was strongly associated with acute and chronic diarrhea, weight loss, CD4+ counts below 100 cells/mm3, older age in patients with leukopenia, and more than 5 stools per day when CD4+ counts were below 100 cells/mm3. We characterized new stool specimens from Venezuelan HIV infected patients using nested PCR-RFLP and sequencing tools, based on the 18S rRNA gene. Three species of Cryptosporidium were identified among these patients on the basis of the 18S rDNA locus: C. hominis, C. parvum, and C. canis. In this study, five C. hominis samples were sub-genotyped with micro- and minisatellite markers. For four of them, the same combination of alleles was found. We studied too the population genetic structure of Cryptosporidium spp. in France and Haiti. In the two areas under study, clonality was predominant, even if some sub-populations exhibited panmixia. Clonal genotypes are considered to be stable in space and time and thus can provide efficient tools for the identification of infection sources or transmission routes. Then, in order to define efficient prevention and control strategies, biology and clinical features of genetically well-defined parasite populations have to be explored. Isolates of Cryptosporidium spp. from human and animal hosts in Iran were also characterized on the basis of both the 18S rRNA gene and the Laxer locus. Three Cryptosporidium species, C. hominis, C. parvum, and C. meleagridis, were recognized, and zoonotically transmitted C. parvum was the predominant species found in humans. To contribute to the comprehension of the dynamics of infection and to investigate biological divergence between different populations of Cryptosporidium, culture tissue and animal models have been used. It has been difficult to find suitable models for cryptosporidiosis, as most mammalians are susceptible to infection only as newborns. However, some Cryptosporidium species can be propagated in either chemically or genetically immunosuppressed mice. Efforts are still needed to develop reproducible animal models allowing both the routine passage of different species and approaching unclear aspects of Cryptosporidium infection, especially in the pathophysiology field. In the second part of this work we developed a model using adult severe combined immunodeficiency (SCID) mice inoculated with Cryptosporidium parvum or Cryptosporidium muris while treated or not with Dexamethasone (Dex) in order to investigate divergences in prepatent period, oocyst shedding or clinical and histopathological manifestations. C. muris-infected mice showed high levels of oocysts excretion, whatever the chemical immunosuppression status. Parasite infection was restricted to the stomach, and had a clear preferential colonization for fundic area in both groups. Among C. parvum-infected mice, Dex-treated SCID mice became chronic shedders. C. parvum-inoculated mice treated with Dex developed glandular cystic polyps with areas of intraepithelial neoplasia. To further characterize this Cryptosporidium induced neoplastic cell transformation, SCID mice treated with Dexamethasone were challenged with different doses of C. parvum oocysts, and euthanatized sequentially after infection for histological examination. Our previous results were confirmed, and it was also found that mice infected with higher inoculums experienced more severe infections. Additionally, neoplastic changes were observed not only in the caecum but also in the stomach and duodenum of some animals. Then, we developed different animal experiments to determine whether other strains of C. parvum or other Cryptosporidium species were able to propagate in our model of SCID mice treated with Dex and to induce the development of premalignant or malignant lesions. All fecal and histological specimens from infected mice treated or not with Dex were negative for either C. molnari, species found in fishes or C. hominis, species considered as anthroponotic.
In fact, our results give insights about the genetic diversity of Cryptosporidium in different regions of the world and about the variable expression of the disease severity according to the infecting species. Furthermore, we have standardized a rodent reproducible model of chronic infection and for the first time we showed an association between Cryptosporidium infection and the induction of dysplasia in the gut of SCID mice
Le genre Cryptosporidium (Apicomplexa : Alveolata) comprend des espèces qui infectent l'intestin d'un grand nombre de vertébrés (l'homme compris). Elles sont la cause de la cryptosporidiose, maladie opportuniste émergente avec un impact considérable chez le patient immunodéficient, notamment sidéen. Ces protistes infectent aussi des sujets immunocompétents dans toutes les latitudes, en déterminant des diarrhées en général autorésolutives. Les oocystes hébergeant les sporozoïtes infectants sont éliminés avec les selles des hôtes infectés, contaminent l'environnement, sont fréquemment véhiculés par les eaux où ils gardent leur pouvoir infectieux pendant longtemps, résistant aux désinfectants usuels. Par ailleurs, étant immédiatement infectieux après leur excrétion, ils peuvent être transmis directement par contact inter-humain.
Sans prescription spécifique, rare dans les faits, la détection d'oocystes de Cryptosporidium n'est pas pratiquée lors de l'examen coproparasitaire conventionnel. De plus, la morphologie étant insuffisante à la distinction des espèces dans le genre, leur identification, qui fait appel à des méthodes moléculaires, est rarement pratiquée, notamment dans les pays en développement. Cependant, elle constitue le seul moyen de déterminer les sources, les voies et les mécanismes de l'infection, informations essentielles au développement de stratégies rationnelles de prévention.
Pour toutes ces raisons, nous avons dans un premier temps cherché à caractériser la variabilité génétique des espèces et de sub-espèces de Cryptosporidium dans différentes régions : Venezuela, Francia, Haïti e Iran. Au Venezuela, chez les 397 patients avec un statut VIH/SIDA confirmé, notre étude a révélé que l'infection par Cryptosporidium est fréquente parmi les patients infectés par le VIH vivant à Caracas, que l'infection, dont la prévalence augmente avec l'âge, s'associe fréquemment à une diarrhée (plus de 5 selles par jour) et à une perte de poids, et qu'un taux de CD4+ <100 cell/mm3 peut être considéré comme un facteur de risque prédictif de cryptosporidiose. L'étude génotypique (PCR-RFLP ciblant l'ADNr 18S de Cryptosporidium sp) a permis d'identifier les espèces isolées ; le génotypage multiloci, qui ciblait des mini- et microsatellites a autorisé une résolution à niveau infra-spécifique. Trois espèces de Cryptosporidium ont été identifiées parmi des nouveaux échantillons fécaux de patients vénézuéliens VIH+: C. hominis, C. parvum et C. canis. L'analyse avec les marqueurs mini- et microsatellites a révélé que les échantillons de C. hominis présentaient une même combinaison d'allèles. Nous avons effectué des études semblables en France, en Haiti et en Iran. Globalement, la structure génétique des populations de ces parasites montre une prédominance clonale, malgré l'existence d'un stade sexuel obligatoire dans le cycle biologique des Cryptosporidium spp. L'origine géographique et l'espèce hôte ont un rôle structurant. En Iran, trois espèces de Cryptosporidium ont été identifiées parmi les échantillons fécaux de 15 personnes et 9 animaux: C. parvum, C. hominis et C. meleagridis.
La seconde partie de ce travail décrit le développement d'un modèle murin immunodéprimé, représenté par des souris SCID (Severe Combined Immunodeficiency), traitées par la dexaméthasone. Ce modèle, destiné à caractériser les isolats de Cryptosporidium spp sur le plan phénotypique, a révélé des divergences marquées entre C. parvum et C. muris. Les espèces C. hominis, spécifique de l'homme, et C. molnari, de poisson, ne se sont pas développées chez la souris SCID traitée ou pas par la déxaméthasone. L'étude histopathologique a confirmé la localisation gastrique (préférentiellement fundique) de C. muris. Les souris SCID sous dexaméthasone inoculées avec C. parvum ont développé des dysplasies iléo-caecales à partir du 35ème jour post-inoculation. Chez les souris non traitées par la déxamethasone euthanasiées 57 jours après l'infection la parasitose était associée à un néoplasie intestinal de bas grade. Des néoplasies de haut grade ont été observés au niveau de l'estomac (souris sous déxaméthasone), principalement dans la zone antrale. Globalement, nos expériences ont montré que C. parvum induit des néoplasies intra-épithéliales de bas et de haut grade dans l'estomac, le duodénum, le caecum et autres régions du côlon. Un tiers de ces souris présentaient des lésions néoplasiques dans plus d'un type d'organe. Des approches immunohistochimiques et biochimiques complètent la caractérisation de ces lésions.
Globalement, ce travail, qui rapporte un modèle expérimental hautement reproductible de cryptosporidiose, fournit des nouvelles informations sur la diversité génétique de Cryptosporidium dans plusieurs régions du monde et sur les différences biologiques entre espèces. En particulier, ce travail démontre pour la première fois la capacité de C. parvum à induire des processus néoplasique chez l'hôte. Cette découverte majeure accroît significativement l'intérêt scientifique des Cryptosporidium spp et suggère que l'impact de ces parasites en santé humaine et animale pourrait être beaucoup plus grand que ce qu'on croî
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Dates et versions

tel-00339175 , version 1 (17-11-2008)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00339175 , version 1

Citer

Gabriela Certad. De la caractérisation génétique et phénotypique de Cryptosporidium (Alveolata : Apicomplexa) à la mise en évidence du rôle de C. parvum dans l'induction de néoplasie digestive. Sciences du Vivant [q-bio]. Université du Droit et de la Santé - Lille II, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00339175⟩
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