Développement de techniques analytiques pour l'évaluation des protéines thérapeutiques et des biomarqueurs par spectrométrie de masse - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2008

Analytical developments for the evaluation of therapeutic proteins and biomarkers by mass spectrometry

Développement de techniques analytiques pour l'évaluation des protéines thérapeutiques et des biomarqueurs par spectrométrie de masse

Résumé

Although liquid chromatography coupled to mass spectrometry is a commonly used technique for low molecular weigh compounds quantification in biological matrixes, it is no longer the case for macromolecules. The aim of this work was to evaluate immunoaffinity extraction coupled to mass spectrometry possibilities and difficulties in recombinant proteins and biomarkers quantification. This approach was first applied for absolute quantification of an intact small therapeutic protein, Epi-hNE4, an inhibitor of human neutrophil elastase. Immunoaffinity extraction from plasma led to a lower limit of quantification of 80 pM. The method was then applied to a therapeutic monoclonal antibody used for the treatment of colorectal cancer, Cetuximab. A lower limit of quantification of 130 pM was achieved through an extraction from plasma involving recognition of its biological target, EGFR. This last development offer possibilities for the immunogenicity testing of therapeutic proteins. The golden standard remains ELISA technique, which we implemented in a screening test for immunogenicity testing of Epi-hNE4, but difficulties encountered suggested that mass spectrometry is a potential alternative. Finally, multiplexed quantitative mass spectrometry was applied to apelins, a peptide biomarkers family between 12 and 36 amino acids, involved in cardiovascular functions. A limit of quantification of 25 pM was achieved, and interestingly, this method brought evidence of the absence of presupposed circulating forms.
Si la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse est un outil de bioanalyse largement utilisé pour la quantification des molécules de faible poids moléculaire dans les fluides biologiques, il n'en est pas de même pour les macromolécules. Au cours de ce travail, nous avons exploré les possibilités et les difficultés d'une méthode d'extraction par immunoaffinité couplée de la spectrométrie de masse pour la quantification des protéines recombinantes et des biomarqueurs. Cette stratégie a tout d'abord été appliquée à une petite protéine thérapeutique, Epi-hNE4, un inhibiteur de l'élastase humaine et pour lequel nous avons obtenu une sensibilité de 80 pM. Cette méthode a également été appliquée à un anticorps thérapeutique utilisé pour le traitement du cancer colorectal, Cetuximab, pour lequel une sensibilité de130 pM a été obtenue grâce à une extraction par l'EGFR, sa cible biologique. Ce dernier développement offre des perspectives pour évaluer l'immunogénecité des protéines thérapeutiques. La méthode de référence est la technique ELISA, que nous avons appliquée à la détection d'anticorps anti-Epi-hNE4, mais les difficultés rencontrées suggèrent que la spectrométrie de masse serait une alternative interessante. Enfin, une dernière application de la spectrométrie de masse pour la quantification multiplexée des biomarqueurs a été menée sur les apelines, une famille de peptides de 12 à 36 acides aminés jouant un rôle crucial dans le système cardiovasculaire. Une limite de détection de l'ordre de 25 pM a été atteinte, et de façon interessante, cette méthode nous a permis de conclure à l'absence des formes supposées circulantes.
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Dates et versions

tel-00341749 , version 1 (25-11-2008)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00341749 , version 1

Citer

Mathieu Dubois. Développement de techniques analytiques pour l'évaluation des protéines thérapeutiques et des biomarqueurs par spectrométrie de masse. Autre. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00341749⟩
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