Etude de la sécrétion régulée par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2008

Regulated secretion studied by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Etude de la sécrétion régulée par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente.

Résumé

Regulated secretion of neuroendocrine cells is a multi-step process involving translocation of secretory granules (SG) toward the plasma membrane (PM), tethering and docking of SG at the PM, exocytosis or fusion of SG membrane with PM, leading to the release of SG contents to the extracellular medium. Electrophysiological and electrochemical methods are useful, but they cannot give information about localization or movement of SG before fusion and about the fate of the SG membrane after fusion. Many in vivo imaging techniques try to answer these questions. The most suited one is TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy) that allows observation of single SG and of their movements in the area just beneath the PM, with evanescence depth ranging from 50 to 300 nm. We have applied this approach to the study of the secretion of BON cells (a cell line derived of a carcinoma). Cells were stimulated by the caged Ca technique, applied for the first time to TIRF microscopy. Using these techniques, we observed fusions which were not accompanied by the flattening of the SG membrane. These empty membranes became targets for sequential fusions with deeper lying vesicles. Overall, ~25% of all exocytotic events occurred via sequential fusion. We also analysed in detail 3D-trajectories of SG shortly before their fusion. We reported that about 40% of SG underwent a 20-nm step toward the PM before fusing ~3 s later. This new observation, the first direct visualization of the transition between tethered and docked states at the PM, might correspond to molecular events involved in the priming steps required for the maturation of SG before fusion.
La sécrétion régulée d'hormones est un processus décomposable en plusieurs étapes : migration des granules de sécrétion (GS) vers la membrane plasmique (MP), accostage et arrimage des GS à la MP, exocytose ou fusion des GS avec la MP permettant la libération du contenu des GS dans le milieu extracellulaire. Bien que très utiles, les méthodes électrophysiologiques et électrochimiques ne donnent d'informations ni sur la localisation ou les mouvements des GS avant fusion, ni sur le devenir de la membrane des GS après fusion. Plusieurs techniques d'imagerie in vivo cherchent à répondre à ces questions. La mieux adaptée est la microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente (TIRFM) qui permet d'observer les mouvements de GS individuels à proximité immédiate de la MP. Nous avons appliqué cette approche à l'étude de la sécrétion des cellules BON (lignée dérivée d'un carcinome). Leur stimulation a été faite par la technique du Ca cagé, appliquée pour la première fois en microscopie TIRF. Après exocytose, nous avons observé et quantifié le phénomène de persistance de la forme d'une partie des GS, ainsi que l'exocytose séquentielle de GS situés plus à distance de la MP. De manière surprenante, l'exocytose séquentielle représente ~25% des événements d'exocytose. L'analyse détaillée des trajectoires en 3 dimensions des GS avant leur fusion nous a montré qu'environ 40% des GS effectuent une transition de 20 nm vers la MP, puis fusionnent dans un délai de ~3 s. Cette observation originale de la transition entre l'accostage et l'arrimage des GS pourrait être la traduction d'évènements moléculaires impliqués dans l'amorçage des GS, nécessaire à la fusion.
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Dates et versions

tel-00343385 , version 1 (01-12-2008)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00343385 , version 1

Citer

S. Tran. Etude de la sécrétion régulée par microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente.. Biologie cellulaire. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00343385⟩
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