Etude par échange isotopique du radical tyrosyle en solution et dans la catalase bovine - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2007

Studies of the tyrosyl radical in solution and within the bovine catalase using isotopic labelling methodology

Etude par échange isotopique du radical tyrosyle en solution et dans la catalase bovine

Résumé

During the dispropornation of hydrogen peroxide yielding water and oxygen by catalase, a heme enzyme, radical intermediates of different nature are formed. Firstly, one species called Compound I appears, which is composed of one oxoferryl moiety coupled to a π-cation porphyrin radical. It has been shown by EPR measurements that for BLC (Beef Liver Catalase), one tyrosyl radical appears after few milliseconds, but the localization and the exact role of this radical remains obscure.
In our laboratory, we have developed a methodology based on tritium labelling to characterize the sites of hydroxyl radical attacks (created by water radiolysis) on each natural amino acid. This method was further used to label peptides, proteins and protein complex. When HO• reacts with the amino acid side chain, mainly by H-abstraction, it forms a carbon-centered radical. We used tritiated phenyl phosphinic sodium salt as a tritium atom donor to scavenge the produced radical. This irreversible label can then be easily analysed.
We have used this labelled compound to understand the sites of the radical production within the catalase by adding the substance when the radical has already formed. EPR measurements were done to monitor the decrease of the tyrosyl radical in the presence of the phosphinic agent. Preliminary results were rather encouraging as the radical seemed to be quenched by the added compound. When the labelling reaction was performed on the BLC, radioactivity was detected within the enzyme. Unfortunately, no specific labelling was detected when the enzyme was digested into peptides by a protease. As the initial compound was inefficient in that case, we decided to check if others structures would be able to transfer one tritium atom to the tyrosyl radical. After synthesis of such compounds, we have tested their reaction with the BLC tyrosyl radical by EPR spectroscopy, to check the decrease of the tyrosyl radical signal. Some of them showed an improved reactivity towards the tyrosyl radical than the initial compound.
In parallel, we have decided to investigate the chemistry of these compounds on a simpler system. We decided to produce the tyrosyl radical in solution via the reaction of tyrosine with hydroxyl radicals, generated by water radiolysis (γ rays). Once the radicals on tyrosine are produced, they were scavenged by a deuterium atom, provided by a 2H-donor. Tthe deuterium incorporation inside tyrosine was measured precisely by mass spectrometry as well as the regioselectivity by 2H NMR. During the course of this study, we also shed light on a so far unknown process, i.e. the self repair of tyrosyl radical. We then focused our attention on this phenomenon and proposed a mechanism to explain our observations.
Lors de la dégradation du peroxyde d'hydrogène en eau et dioxygène catalysée par les hémoenzymes à fer de type catalase et peroxydase, il se forme à l'échelle de la milliseconde un intermédiaire réactionnel radicalaire porté par la porphyrine. Dans le cas de l'enzyme modèle utilisée, la catalase de foie de bœuf, il a été montré par des études de spectroscopie RPE que ce radical est ensuite délocalisé sur un résidu tyrosyle de la chaîne polypeptidique. A ce jour, on ne connaît pas l'exacte localisation du résidu impliqué, donc le rôle de ce site d'oxydation alternatif.
Par ailleurs, il a été montré au laboratoire que l'identification et la quantification des radicaux formés sur les acides aminés d'une protéine par l'attaque de radicaux hydroxyle sont possibles. Cette méthode est basée sur le marquage au tritium des résidus acides aminés. Notre approche est basée sur la génération de radicaux hydroxyle par radiolyse de l'eau. Les radicaux hydroxyle formés arrachent un hydrogène sur la chaîne latérale des acides aminés et génèrent ainsi un radical carboné. Il est ensuite “réparé” in situ par un composé, le sel sodique de l'acide phénylphosphinique tritié, qui permet d'introduire un atome de tritium à la place de l'hydrogène précédemment arraché. Cet atome de tritium sert de marqueur pour détecter les sites de formation des radicaux.
Nous avons donc utilisé les propriétés de réparation du vecteur tritié pour identifier quelle est la tyrosine impliquée dans les transferts d'électrons de la BLC. Même s'il a été montré par RPE que la disparition du radical porté par la tyrosine est effective en présence de l'agent de réparation, les études de marquage n'ont pas abouti à déterminer l'exacte localisation du radical. Une des raisons invoquées est le manque d'efficacité de l'agent de réparation pour transférer son atome d'hydrogène. C'est pourquoi d'autres composés capables eux aussi de fournir un atome d'hydrogène par voie radicalaire ont été synthétisés puis testés sur ce système enzymatique par une étude de spectroscopie RPE.
En parallèle, nous avons voulu comprendre les mécanismes d'action des ces mêmes composés sur un système modèle en générant des radicaux sur la tyrosine en solution par radiolyse de l'eau. La méthode consiste à produire dans une solution aqueuse de tyrosine des radicaux hydroxyle, qui vont former les radicaux tyrosyle. Les radicaux ainsi générés peuvent être ensuite réparés par un atome de deutérium fourni par un donneur. L'incorporation en deutérium et la régiosélectivité de l'attaque sont ensuite analysées par spectrométrie de masse et RMN 2H. L'irradiation de solution de tyrosine en présence des différents composés choisis s'est révélée difficile à analyser, en raison notamment de la difficulté à déterminer la proportion de radicaux hydroxyle réagissant avec l'agent réparateur au lieu de la tyrosine, mais surtout en raison de l'incorporation inattendue de deutérium dans la tyrosine en l'absence de tout agent de transfert. Ce phénomène jusqu'alors inconnu a, dès lors, retenu toute notre attention. Nous avons alors focalisé nos travaux sur la compréhension des processus intervenant dans l'autoréparation de la tyrosine et ainsi proposé un mécanisme pour expliquer nos observations.
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Dates et versions

tel-00361211 , version 1 (13-02-2009)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00361211 , version 1

Citer

Sophie Oppilliart. Etude par échange isotopique du radical tyrosyle en solution et dans la catalase bovine. Chimie. Université Paris Sud - Paris XI, 2007. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00361211⟩

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