Caractérisation de 2 transporteurs ABC (“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue : YheI/YheH de Bacillus subtilis et Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2008

Characterization of 2 bacterial ABC (“ATP-Binding Cassette”) transporters of unknown function : YheI/YheH from Bacillus subtilis and Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis

Caractérisation de 2 transporteurs ABC (“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue : YheI/YheH de Bacillus subtilis et Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis

Carmen Galian Barrueco
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 858895

Résumé

The multidrug resistance (MDR) phenotype of cancer cells is mostly associated with overexpression of membrane proteins which belong to the large superfamily of ABC (« ATP binding cassette ») transporters. These proteins couple ATP hydrolysis to the efflux of chemotherapeutic drugs. Homologous transporters from bacteria have been involved in antibiotic resistance.
Two new bacterial ABC transporters, Rv1747 from Mycobacterium tuberculosis and YheI/YheH from Bacillus subtilis, putatively involved in antibiotic resistance, have been studied here after heterologous expression in Escherichia coli and isolation of inverted membrane vesicles. This system has proved not to be useful for the study of Rv1747, due probably to codon usage differences between E. coli and M. tuberculosis. By contrast, we reached a high expression level of YheI/YheH which allowed the characterization of its transport and ATP hydrolysis activities. We thus showed that these two proteins associate to form a heterodimeric transporter able to efflux several structurally unrelated drugs, and that the two subunits play different roles in the catalytic mechanism. Finally, we managed to purify YheI/YheH in high yield, in a functional and stable state, which allowed us to extend its biochemical characterization and to obtain 2D crystals for structural studies by electron microscopy.
L'émergence du phénotype MDR (« multidrug resistance») des cellules cancéreuses est souvent corrélée à la surexpression de protéines membranaires appartenant à la superfamille ABC (« ATP binding cassette »). Ces protéines couplent l'hydrolyse de l'ATP au transport d'agents chimiothérapeutiques vers l'extérieur des cellules. Chez les bactéries, des transporteurs homologues ont été impliqués dans certains cas de résistance aux antibiotiques.
Deux nouveaux transporteurs ABC bactériens, Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis et YheI/YheH de Bacillus subtilis, potentiellement impliqués dans la résistance aux antibiotiques, ont été étudiés ici en réalisant une expression hétérologue chez Escherichia coli et en isolant des vésicules de membrane inversées. Ce système s'est avéré inapproprié pour l'étude du transporteur Rv1747, à cause vraisemblablement des différences entre E. coli et M. tuberculosis dans l'usage des codons. En revanche, nous avons obtenu un degré important de surexpression de YheI/YheH qui nous a permis de caractériser son activité de transport et d'hydrolyse de l'ATP. Nous avons ainsi montré que les deux protéines, YheI et YheH, s'associent pour former un exportateur hétérodimérique capable de transporter de multiples drogues, et que le rôle des deux sous-unités n'est pas identique dans le mécanisme catalytique du transporteur. Enfin, nous avons réussi à purifier le transporteur YheI/YheH avec un rendement élevé et dans un état fonctionnel stable, permettant d'approfondir sa caractérisation biochimique ainsi que d'obtenir des cristaux bidimensionnels pour une étude structurale par microscopie électronique.
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Dates et versions

tel-00369447 , version 1 (19-03-2009)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00369447 , version 1

Citer

Carmen Galian Barrueco. Caractérisation de 2 transporteurs ABC (“ATP-Binding Cassette”) bactériens de fonction inconnue : YheI/YheH de Bacillus subtilis et Rv1747 de Mycobacterium tuberculosis. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00369447⟩
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