Etude de mécanismes de l'endocytose chez Dictyostelium discoideum. Caractérisation des effets inhibiteurs de la caféine et de la cycloheximide. Analyse du pH endosomal. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 1991

Mechanism of endocytosis in Dictyostelium discoideum. Characterization of the inhibitory effects of caffeine and cycloheximide. Analysis of endosomal pH.

Etude de mécanismes de l'endocytose chez Dictyostelium discoideum. Caractérisation des effets inhibiteurs de la caféine et de la cycloheximide. Analyse du pH endosomal.

Résumé

Endocytosis pathways in Dictyostelium discoideum amoeba were investigated by the study of endocytic compartment acidification. The mechanisms of inhibition by caffeine and cycloheximide, two drugs that are not perturbing cellular energetic metabolism, were also explored.
Fluorescein isothiocyanate labeled dextran (FITC dextran) was used as a fluid phase marker to quantify pinocytosis kinetics. Fluid internalization is more active in nutritive medium as compared to plain buffer. In both cases, biphasic kinetics are observed with a linear initial phase followed by a plateau corresponding to the dynamic equilibrium of fluid phase marker influx and efflux. Kinetics are satisfactorily modeled on the basis of a single endocytic compartment. Pinocytosis decreases as a function of temperature with an activation energy of 27 kcal/mol.
FITC dextran was used as a pH probe. At pinocytosis plateau, endosomal pH is 5,8 (+/- 0,2) and this value is independent of extracellular pH. Weak bases and other agents such as carbonyl cyanide m-chloro phenylhydrazone or monensin increase endosomal pH. Measurement of pH during the early phase of FITC dextran entry (t<15 min) shows a more acidic endocytic compartment. Endocytic pH remains stable during the initial stage of differentiation induced by starvation.
Caffeine immediately inhibits all endocytic activities in Dictyostelium amoeba including fluid phase pinocytosis, phagocytosis and lysosomal enzyme secretion. Axenic growth is also inhibited. Other methylxanthines, such as theobromine, theophylline or paraxanthine have no effect on endocytosis or growth. It is hypothesized that endocytosis inhibition is a consequence of intracellular Ca2+ homeostasis perturbation.
Cycloheximide, an eukaryotic protein synthesis inhibitor, blocks all endocytic activities in Dictyostelium after a 10-min latency period. Other protein synthesis inhibitors such as anisomycin, emetine, pactamycin or puromycin also inhibit endocytosis in Dictyostelium despite having both structure and mechanism of inhibition different from cycloheximide. It is postulated that endocytosis inhibition by protein synthesis inhibitors involves a regulatory stress response.
Les voies d'endocytose chez l'amibe Dictyostelium discoideum ont été explorées en étudiant l'acidification des compartiments endocytaires et en caractérisant l'action de la caféine et de la cycloheximide, deux inhibiteurs qui ne modifient pas le métabolisme énergétique de la cellule.
Le dextran marqué par l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC dextran) a été employé comme sonde de phase fluide. Dictyostelium montre une internalisation de fluide plus active dans un milieu nutritif que dans un milieu non nutritif. Dans les deux cas, une cinétique biphasique est observée avec une première phase linéaire en fonction du temps, suivie d'un plateau qui correspond à l'équilibre dynamique entre l'entrée et la sortie de fluide. Les cinétiques sont modélisables sur la base d'un compartiment endocytaire unique. L'activité pinocytaire diminue avec la température avec une énergie d'activation de 27 kcal/mol.
Le FITC dextran a été utilisé comme sonde de pH. Au plateau de pinocytose, le compartiment endosomal est à une valeur moyenne de pH 5,8 (+/- 0,2) qui est indépendante du pH extracellulaire. Les bases faibles et d'autres agents comme la monensine ou le carbonyl cyanide m-chloro phenylhydrazone, diminuent l'acidité du compartiment endosomal. La détermination du pH endosomal pendant les phases initiales (t<15 min) met en évidence un compartiment plus acide que le compartiment endosomal majeur. Le pH endosomal reste constant pendant l'engagement de la différenciation induite par une carence nutritionnelle.
La caféine inhibe de façon immédiate toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium : la pinocytose de phase fluide, la phagocytose et la sécrétion des enzymes lysosomales. La caféine est aussi un inhibiteur de la croissance axénique dans la même gamme de concentrations que celles qui inhibent l'endocytose. D'autres méthylxanthines, comme la théobromine, la théophylline ou la paraxanthine sont sans effet sur l'endocytose ou la croissance de Dictyostelium. L'hypothèse pour expliquer l'effet inhibiteur de la caféine est une perturbation de l'homéostasie du Ca2+ intracellulaire.
La cycloheximide est un inhibiteur de la synthèse protéique chez les eucaryotes. Après une phase de latence d'environ 10 minutes, la cycloheximide bloque toutes les activités endocytaires chez l'amibe Dictyostelium. D'autres inhibiteurs de la synthèse protéique des cellules eucaryotes qui possèdent des modes d'action et des structures différents, tels que l'anisomycine, l'émétine, la pactamycine et la puromycine inhibent aussi l'endocytose. L'hypothèse envisagée pour rendre compte de l'inhibition de l'endocytose par les inhibiteurs de la synthèse protéique fait intervenir des mécanismes de réponse au stress.
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  • HAL Id : tel-00370319 , version 1

Citer

Carlos Gonzalez-Hernandez. Etude de mécanismes de l'endocytose chez Dictyostelium discoideum. Caractérisation des effets inhibiteurs de la caféine et de la cycloheximide. Analyse du pH endosomal.. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 1991. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00370319⟩

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