Réparation de l'ADN par une protéine « Radical-SAM » : Etude de la Spore Photoproduct Lyase - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2008

Study of Spore Photoproduct Lyase, a “Radical-SAM” enzyme involved in DNA repair

Réparation de l'ADN par une protéine « Radical-SAM » : Etude de la Spore Photoproduct Lyase

Résumé

The major photoproduct of UV-irradiated DNA from bacterial spores is 5-(a-thyminyl)-5,6-dihydrothymine, a unique thymine dimer called Spore Photoproduct (SP). At the beginning of germination, this photoproduct is specifically repaired by the Spore Photoproduct Lyase (SPL), regenerating the two thymine monomers. SPL belongs to a family of iron-sulfur enzymes named « Radical-SAM ». In this family, proteins have a [4Fe-4S] cluster, chelated by three cysteines highly conserved constituting the “Radical-SAM” motif CxxxCxxC, and use S-Adenosylmethionine as a cofactor. They all use a radical based mechanism, initiated by 5'-deoxyadenosyl radical formation, derived from the homolytic cleavage of S-Adenosylmethionine by the reduced [4Fe-4S] cluster. Here, we have characterized, by biochemical and spectroscopic methods, the recombinant SPL from Clostridium acetobutylicum or Bacillus subtilis. Furthermore, we have synthesized a novel substrate called SPTpT under the form of a dinucleoside monophosphate. The structural characterization of this compound, using NMR spectroscopy, has been carried out. Moreover, this substrate is recognized and efficiently repaired by this enzyme, providing a convenient way to investigate the repair mechanism. Finally, the sequence of all SPL contains a fourth well-conserved cysteine. Site-directed mutagenesis shows that this residue is strongly involved in the repair mechanism but not in the cluster formation. The role of this cysteine 141 in the catalytic mechanism has been studied.
Chez les spores de bactéries, le photoproduit le plus abondant formé dans l'ADN irradié par les UV est un dimère de thymines appelé Photoproduit des spores (SP, 5-(a-thyminyl)-5,6-dihydrothymine). Au début de la germination, ce photoproduit est spécifiquement réparé par une enzyme, la Spore Photoproduct Lyase (SPL), régénérant les deux résidus thymine originaux. Cette enzyme est une protéine Fe-S qui appartient à la famille des « Radical-SAM ». Les protéines de cette famille d'enzymes possèdent un centre [4Fe-4S], coordiné par 3 cystéines conservées organisées selon le motif CxxxCxxC, et utilisent la SAdénosylméthionine comme cofacteur. Elles fonctionnent toutes selon un mécanisme
radicalaire, initié par la formation du radical 5'-désoxyadénosyle issu de la coupure homolytique de la S-Adénosylméthionine par le centre [4Fe-4S] réduit. Dans ce travail, nous avons effectué une caractérisation biochimique et spectroscopique des SPL de Clostridium acetobutylicum et Bacillus subtilis. Par ailleurs, nous avons synthétisé un substrat minimum sous la forme d'un dinucléoside monophosphate appelé SPTpT, pour lequel une caractérisation structurale par RMN a été réalisée. Le SPTpT est reconnu et efficacement réparé par l'enzyme, ce qui nous a permis d'obtenir de nouvelles informations sur le mécanisme enzymatique de réparation. Enfin, la séquence primaire des SPL contient une 4e cystéine conservée, essentielle à la réparation, mais qui n'est pas impliquée dans la coordination du centre [Fe-S]. Nous nous sommes intéressés au rôle de cette cystéine dans le mécanisme de réparation grâce à l'étude biochimique et enzymatique du mutant SPLC141A.
Fichier principal
Vignette du fichier
these_AlexiaChandorProust.pdf (15.28 Mo) Télécharger le fichier

Dates et versions

tel-00376741 , version 1 (20-04-2009)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00376741 , version 1

Citer

Alexia Chandor-Proust. Réparation de l'ADN par une protéine « Radical-SAM » : Etude de la Spore Photoproduct Lyase. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00376741⟩
214 Consultations
1795 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More