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Thèse Année : 2005

CRYSTALLOGRAPHIC STUDY OF THE PROTEIN IRP1 (IRON REGULATORY PROTEIN 1), A REGULATOR OF THE IRON HOMEOSTASIS

ETUDE CRISTALLOGRAPHIQUE DE LA PROTEINE IRP1 (IRON REGULATORY PROTEIN 1), UN REGULATEUR DE L'HOMEOSTASIE DU FER.

Jérôme Dupuy

Résumé

In animals, two highly homologous cytosolic Iron Regulatory Proteins, IRP1 and IRP2, are involved in the metabolism of this biologically essential metal. Both proteins can bind to specific mRNA regions called Iron Responsive Elements and thereby control the expression of proteins involved in the uptake, storage and utilization of iron. IRP1 loses its RNA-binding ability in its major form found in most tissues and normal cell cultures, wherein it contains a [4Fe-4S] cluster and becomes a cytosolic aconitase, catalyzing the conversion of citrate to isocitrate. The exact physiological role of IRP1 is still not entirely clear, but there are indications that it may be involved in oxidative stress response.
Human IRP1 has a molecular mass of 98 kDa. We have been able to crystallize this [4Fe-4S]-containing form under anaerobic conditions and collected X-ray diffraction data up to a maximum resolution of 1.85 Å. Attempts to solve the structure by molecular replacement, using the structure of the homologous bovine mitochondrial aconitase which shows about 22% sequence identity with IRP1, did not work. Subsequently, a second slightly different crystal form diffracting to 2.5 Å resolution was obtained. Anomalous signals of the iron-sulfur cluster and a fortuitous zinc site in the native enzyme and data from an isomorphous gold derivative of this crystal form have been successfully used for phasing. The structure have been refined and analyzed with respect to its aconitase and potential RNA-binding functions, using the results from numerous site-directed mutagenesis and other studies that are available in the literature.
Chez les mammifères, deux protéines cytosoliques régulatrices du fer, IRP1 et IRP2 (Iron Regulatory Proteins), sont impliqué dans le métabolisme de ce métal biologiquement essentiel. Ces protéines peuvent fixer des régions spécifiques d'ARNm, appelée Iron Responsive Elements, et ainsi contrôler l'expression des protéines impliquées dans l'importation, le stockage et l'utilisation du fer. IRP1 peut perdre sa capacité de fixer l'ARN en acquièrent un agrégat [4Fe-4S] lui conférant une activité d'aconitase cytosolique catalysant la conversion du citrate en isocitrate. Le rôle physiologique exact d'IRP1 n'est pas encore complètement clair mais des indications laissent à penser qu'elle serait impliquée dans la réponse au stress oxydant.
L'IRP1 humaine a une masse moléculaire de 98 kDa. La forme contenant un agrégat [4Fe-4S] a été cristallisée dans des conditions anaérobiques et un jeu de donnée allant jusqu'à 1,85 Å a été collecté. Un remplacement moléculaire a été tenté afin de résoudre la structure de la protéine à partir de la structure de l'aconitase mitochondriale de bœuf qui présente 22% d'identité de séquence avec IRP1 mais sans succès. Par la suite, une seconde forme cristalline diffractant à 2,5 Å de résolution a été obtenue. Le signal anomal de l'agrégat fer-soufre ainsi que celui d'un site zinc inattendu dans l'enzyme native ont été utilisés en plus des données isomorphes d'un dérivés or pour résoudre le problème de la phase. La structure a été affinée et analysée en respectant la fonction aconitase et celle de fixation d'ARN de la protéine et ce en utilisant les résultats des différentes études de mutagenèse dirigée disponibles dans la littérature.
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Dates et versions

tel-00411037 , version 1 (25-08-2009)

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  • HAL Id : tel-00411037 , version 1

Citer

Jérôme Dupuy. ETUDE CRISTALLOGRAPHIQUE DE LA PROTEINE IRP1 (IRON REGULATORY PROTEIN 1), UN REGULATEUR DE L'HOMEOSTASIE DU FER.. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2005. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00411037⟩
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