Caractérisation structurale et fonctionnelle des composants du pilus de Streptococcus pneumoniae : vers une meilleure compréhension de la biogenèse des pili. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2009

Structural and functional characterization of pilus components of Streptococcus pneumoniae : toward a better understanding of the biogenesis of pili.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des composants du pilus de Streptococcus pneumoniae : vers une meilleure compréhension de la biogenèse des pili.

Résumé

Streptococcus pneumoniae, a piliated pathogen, is the causative agent of otitis, pneumonia, bacteremia, and meningitis, and is a major cause of community-acquired illnesses, especially in the very young and the elderly. Pili have been shown to play key roles in pneumococcal infection, and although the pilus biogenesis mechanism has been well studied in Gram-negative bacteria, it remains poorly understood in Gram-positive species. Pilus assembly in S. pneumoniae involves a membrane-associated macromolecular machinery encoded on a single pathogenicity islet, and includes the backbone fiber protein (RrgB), two minor pilins (RrgA and RrgC), and three dedicated sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3). These pilin subunits contain the recognition LPXTG motif of sortases. Here, we provide structural, biochemical, and microbiological insight into this novel pilus formation mechanism by (1) reconstituting the main backbone fiber of the pneumococcal pilus in vitro upon identification that SrtC-1 acts as the main pilus-polymerase and can form RrgB fibers; (2) employing electron microscopy in order to visualize fibers produced in vitro and showing that they structurally mimic the pneumococcal pilus backbone; (3) confirming this result in vivo; (4) solving the high resolution crystal structures of SrtC-1 and SrtC-3 which reveal active sites whose access is controlled by flexible lids, unlike in nonpilus sortases, suggesting that substrate specificity is dictated by surface recognition coupled to lid opening. In addition, we characterize the catalytic triad present in the sortase active site as well as lid residues, and identify key amino acids which are relevant for sortase activity as well as structural stabilization.
Streptococcus pneumoniae est un pathogène majeur chez l'homme, responsable d'otites sévères, de pneumonies, de bactériémies et de méningites. C'est une cause majeure de mortalité et de morbidité, essentiellement chez les enfants et les personnes âgées. Il a été récemment découvert que certaines souches virulentes de S. pneumoniae portent à leur surface des pili, considérés comme un important facteur de virulence. Cependant, contrairement aux bactéries à Gram-négatif, peu de choses sont connues sur la structure des pili des bactéries à Gram-positif. Les gènes requis pour la production des pili chez S. pneumoniae sont localisés sur un îlot de pathogénicité et codent pour 3 sortases (SrtC-1, SrtC-2, SrtC-3) et 3 protéines structurales (RrgB, qui forme le corps du pilus, RrgA et RrgC). Celles-ci contiennent un motif LPXTG, motif de reconnaissance des enzymes sortases. Dans ce travail, nous apportons de nouvelles informations structurale, biochimique et microbiologique sur le mécanisme de formation du pilus par (1) une reconstitution du corps de la fibre in vitro après avoir identifié SrtC-1 comme étant la principale pilus-polymérase; (2) une étude de microscopie électronique montrant que les fibres produites in vitro mimaient structuralement les pili ; (3) une étude in vivo confirmant les résultats obtenus in vitro; (4) la résolution de la structure par cristallographie aux rayons X de SrtC-1 et SrtC-3 qui révèle un site actif dont l'accès est contrôlé par un couvercle flexible, contrairement aux sortases non impliquées dans la biogenèse de pili. Ces observations suggèrent que la spécificité de substrat est dictée par une reconnaissance de surface couplée à une ouverture du couvercle. Dans un second temps, nous avons caractérisé la région du site actif de SrtC-1 : la triade catalytique mais aussi les deux résidus du couvercle qui s'ancrent dans le site actif. L'identification de résidus clés dans l'activité sortasique aussi bien que dans la stabilisation structurale a été ainsi mis en évidence.
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Dates et versions

tel-00537697 , version 1 (19-11-2010)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00537697 , version 1

Citer

Clothilde Manzano. Caractérisation structurale et fonctionnelle des composants du pilus de Streptococcus pneumoniae : vers une meilleure compréhension de la biogenèse des pili.. Biochimie [q-bio.BM]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2009. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00537697⟩

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