Etude du cycle cytotoxique des NO-Synthases : production et activation du peroxynitrite - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2007

Etude du cycle cytotoxique des NO-Synthases : production et activation du peroxynitrite

Résumé

NO-synthases, sole sources of nitric oxide (NO) in mammals, are involved in numerous processes of signalling (arterial pressure regulation, neuronal communication) but also of cytotoxicity (non specific immune response). This physiological duality, correlated to NOS isoforms, could be explained by a production of either NO (for signalling), either peroxynitrite (PN). Indeed, PN is a highly oxidizing molecule associated to several pathologies. Nevertheless, in vivo, PN must be activated to exert its toxicity. The aim of this thesis was to investigate PN activation by NOSs and the parameters that favour its production by NOSs. We showed that the interaction between NOSs and PN leads to PN isomerization or activation depending on pH value. PN is activated by a homolytic cleavage that induces the concomitant formation of an oxoferryl intermediate and a nitrogen dioxide radical (NO2). Depending on the isoform, this oxoferryl/NO2 pair can either recombine to nitrate (detoxification) either oxidize and/or nitrate external compounds (toxicity). This difference of interaction between PN and each NOS could contribute to the biological specificity of the isoforms. Finally, we started the characterization of the physico-chemical parameters that could control PN production by NOSs. In particular, we were interested in the Fe(II)-NO complex oxidation potential. We showed that this complex was in thermal equilibrium between three conformations, which sets a new and original basis for the structure-function analysis of this complex and the study of PN production by the different NOSs.
L'activité des NO-synthases (NOS), unique source de monoxyde d'azote (NO) chez les mammifères, s'inscrit dans des processus de signalisation (régulation de la pression artérielle, communication neuronale) et de cytotoxicité (réponse immunitaire non spécifique). Pour rendre compte de cette dualité physiologique, une partition de leur cycle catalytique a été proposée : une voie produirait du NO (signalisation), et une autre conduirait à la formation de peroxynitrite (ONOOH, PN), molécule hautement oxydante aujourd'hui associée à de nombreuses pathologies. Cependant le PN doit être activé in vivo pour exercer sa toxicité, réaction qui peut être catalysée par des porphyrines à fer et donc potentiellement par les NOSs. Dans ce contexte, l'objectif de cette thèse était d'étudier le devenir du PN synthétisé par les NOSs et d'analyser les paramètres favorisant sa production afin d'expliquer le rôle cytotoxique de l'isoforme inductible et la spécificité physiologique de chaque isoforme. Tout d'abord, nous avons étudié l'interaction des NOSs avec PN. Nous avons mis en évidence par une analyse cinétique que quelles soient les conditions expérimentales, le PN synthétisé au site actif de l'enzyme n'était pas libéré mais pris en charge par l'hème pour former d'autres oxydes d'azote. Nous avons proposé un mécanisme en plusieurs étapes pour cette réaction, qui mène à l'isomérisation ou à l'activation du PN suivant que le pH est alcalin ou acide. Dans le cas d'une activation du PN, nous avons observé un intermédiaire pour NOS avec un maximum d'absorption autour de 443 nm qui pourrait correspondre à un complexe oxoferryl, FeIV=O, et qui serait formé par rupture homolytique de la liaison O-O du complexe NOS-PN [FeIII-OONO] avec libération concomitante d'un radical •NO2. Des études comparatives de réactivité du système {NOS + PN} pour les différentes isoformes ont montré que la paire {FeIV=O...•NO2} conduit soit à l'augmentation des processus d'oxydation à un électron et de nitration de composés extérieurs, soit à la détoxication partielle ou totale du PN. La balance entre ces deux voies (toxicité versus détoxication) semble dépendre de la capacité des différentes isoformes à libérer ou à piéger les radicaux •NO2. Ainsi la diversité de réaction entre NOS et PN (génération ou extinction d'un stress oxydant) pourrait rendre compte de la spécificité physiologique des différentes isoformes. Ensuite, nous nous sommes intéressés à caractériser les paramètres physico-chimiques qui peuvent contrôler la production de PN par les NOSs ou l'oxydation du complexe FeII-NO. Dans un premier temps nous avons développé une nouvelle méthodologie de spectroélectrochimie, qui devrait permettre la mesure fiable du potentiel redox du couple FeII-NO/FeIII-NO. Nous avons mis en évidence des effets distincts du substrat L-arginine et du co-facteur H4B des NOSs sur la stabilisation de la structure en dimère de la protéine. Nous avons également démontré que l'utilisation de l'analogue H2B du co-facteur naturel ne peut être utilisé en tant que mime pour des expériences de réactivité puisqu'il n'assure pas cette structuration. Dans un deuxième temps nous avons étudié les propriétés structurales et électroniques des complexes FeII-NO par spectroscopie RPE classique et à impulsions. Nous avons mis en évidence l'existence de trois géométries pour les complexes FeII-NO, et avons pu établir une relation d'équilibre thermique entre deux d'entre elles, intrinsèquement contrôlée par l'environnement de l'hème (présence et nature du substrat, type d'isoforme). Ces résultats indiquent que les études structure/fonction des complexes FeII-NO ne doivent pas être menées à basse température pour représenter la réalité physiologique des NOSs. En conclusion, ces travaux représentent la première étude de l'interaction entre le PN et les NOSs et mettent en évidence leur capacité à générer, amplifier ou éteindre un stress oxydant cellulaire. Ils ouvrent des perspectives nouvelles et originales pour la compréhension des paramètres induisant ce stress in vivo, ou contrôlant la spécificité biologique des différentes isoformes. 5

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  • HAL Id : tel-00553493 , version 1

Citer

Amandine Marechal. Etude du cycle cytotoxique des NO-Synthases : production et activation du peroxynitrite. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Paris Sud - Paris XI, 2007. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00553493⟩

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