Conception d'inhibiteurs du domaine SH3 de la protéine RasGAP à activité anti-tumorale potentielle - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2005

Design and identification of RasGAP-SH3 domain inhibitors exhibiting potential antitumoral activity

Conception d'inhibiteurs du domaine SH3 de la protéine RasGAP à activité anti-tumorale potentielle

Jerome Samson
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 902003

Résumé

This work aims at the inhibition of the Ras signaling pathway by protein-protein interaction targeted drug design. Within this frequently implicated in human tumors pathway, the RasGAP protein plays two apparently contrary roles, both as a negative regulator and a positive Ras effector. The SH3 domain of RasGAP has already been identified by independent teams as a relevant therapeutic target (Tocqué et al., 1997). More recently, we have brought a new evidence of this relevance by the identification of Aurora kinases as RasGAP-SH3 binding partners. In the present work in collaboration with Aptanomics, by the use of peptide aptamers, we bring a new validation of this target. Using a yeast two-hybrid screening, we have discovered new synthetic proteins (aptamers) specifically interacting with RasGAP-SH3 domain. Moreover, the expression of these aptamers in tumoral cultured cells leads to antitumoral-like phenotypes : colony forming capacity and cell viability decrease. This aptamers representing only the first step towards rational design of small molecule inhibitors of RasGAP-SH3, we have then synthesized peptides derived from aptamers variable loops which are responsible for their interaction with the SH3 domain, and evaluated their affinity by fluorescence anisotropy experiments. To date, our best molecule is a sub-micromolar-affinity cyclic peptide. Using 15N-enriched purified SH3 domain and its previously solved structure (Yang et al., 1994), we have determined by NMR spectroscopy the binding fingerprint of this molecule on our target. This structural data should lead within a short time to modifications of our peptide inhibitors, in order to increase their affinity, solubility and cell-penetrating capacity. These molecules would then be subjected to in vitro and in vivo evaluation of their anti-tumoral activity. In the meanwhile, the fluorescently-labeled peptides we have synthesized will be used as reference competitors during fluorescence anisotropy-based chemical libraries screenings. Both rational and screening approach will certainly soon lead to the identification of small molecule-inhibitors of the RasGAP-SH3 domain.
L'objectif de cette thèse consiste à inhiber la voie de signalisation liée aux protéines Ras, très fréquemment impliquée dans les tumeurs humaines, en concevant des inhibiteurs d'interactions protéine-protéine. Au sein de cette voie, la protéine RasGAP joue un rôle particulier, à la fois régulateur négatif et effecteur de Ras. La cible thérapeutique constituée par le domaine SH3 de la protéine RasGAP avait déjà été identifiée par plusieurs équipes (Tocqué et al., 1997). Plus récemment, notre laboratoire a complété ces travaux par l'identification des protéines Aurora comme partenaires de RasGAP-SH3. En collaboration avec Aptanomics, en mettant en oeuvre la technique des aptamères peptidiques, nous avons apporté une nouvelle validation de cette cible : nous avons obtenu par un crible double-hybride de nouvelles protéines synthétiques (aptamères) interagissant spécifiquement avec le domaine SH3 de RasGAP, et dont l'expression dans des cellules tumorales provoque une diminution de la capacité à former des colonies et de la viabilité cellulaire. Afin d'amorcer une démarche de conception rationnelle d'inhibiteurs de ce SH3, nous avons synthétisé les peptides exposés à la surface de ces aptamères et responsables de leur interaction avec RasGAP-SH3. Nous avons ensuite mesuré l'affinité de ces peptides pour RasGAP-SH3 par anisotropie de fluorescence. Nous avons ainsi obtenu un peptide cyclique dont l'affinité pour le domaine SH3 est de l'ordre de quelques centaines de nanomolaire, et dont nous avons déterminé l'empreinte sur ce domaine enrichi en 15N par RMN, en nous appuyant sur la structure du domaine, déjà résolue au laboratoire (Yang et al., 1994). Les données structurales que nous avons obtenues devraient permettre, dans un court délai, de proposer des modifications de ces peptides, afin d'augmenter l'affinité de nos inhibiteurs et de les vectoriser pour leur conférer une activité sur cellules tumorales en culture. Enfin, ces peptides, rendus fluorescents par leur couplage à un fluorophore, vont être utilisés comme ligands de référence dans un crible de chimiothèque à haut débit, afin de découvrir de petites molécules inhibitrices du domaine SH3 de RasGAP.
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Dates et versions

tel-00596955 , version 1 (30-05-2011)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00596955 , version 1

Citer

Jerome Samson. Conception d'inhibiteurs du domaine SH3 de la protéine RasGAP à activité anti-tumorale potentielle. Médicaments. Université René Descartes - Paris V, 2005. Français. ⟨NNT : 2005PA05P607⟩. ⟨tel-00596955⟩
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