Mise au point de la spectroscopie de fluorescence pour la taxonomie des Pseudomonads. Application à la caractérisation d'isolats d'ateliers carnés - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2009

Development of fluorescence spectroscopy for Pseudomonads. Application to the characterization of isolates of meat workshops

Mise au point de la spectroscopie de fluorescence pour la taxonomie des Pseudomonads. Application à la caractérisation d'isolats d'ateliers carnés

Résumé

In the methodological field relating to microorganisms characterization, spectroscopic methods such as the fluorescence spectroscopy appear to be particularly appreciable tools. Their power is strengthened by the use of chemometrics which permit to treat all the spectral information. This work presents the elaboration stages of the method for Pseudomonads characterization, which form one of the most adaptative flora and present the biggest phenotypic and genotypic diversity so far depicted. Through the use of intrinsic fluorophores (NADH, aromatic amino acids + nucleic acids and tryptophan), the analysis of bacterial suspensions directly prepared from colonies permits to obtain more than 90% of good classification for reference strains even when divided in very related taxa. Synchronous fluorescence spectroscopy was successfully developed coupled with acquisition of spectra directly from colonies on agar plates using an optic fiber. The variance analysis has shown an excellent repeatability of the results, but also no significant effects of "the optical fibre position in the colony" nor of the incubation time before reading (between 48 and 72 hours). Sensitivity and selectivity reached 100% for bacterial discrimination at the genus, species or subspecies level. In these conditions, the method appears as a very reliable tool for a taxonomic purpose since our results are in agreement with the generally admitted rRNA and DNA bacterial homology grouping but they also bring out additional information about strain relatedness. In the case of environmental isolates, the method allows good discrimination, even for strains for which ambiguity still remained after PCR and API 20 NE identification. It can also be a powerfull tool to study bacterial traceability.
Dans le champ des méthodologies dédiées à la caractérisation des microorganismes, les méthodes spectroscopiques comme la spectroscopie de fluorescence apparaisent des outils particulièrement sensibles. Leur puissance est renforcée par l'utilisation d'outils chimiométriques qui autorisent le traitement de l'ensemble des informations spectrales. Ce mémoire présente les étapes de mise au point de la méthode pour la caractérisation des Pseudomonads qui constituent une des flores les plus adaptatives et présentant la plus grande diversité phénotypique et génotypique décrite à ce jour. Par l'utilisation de fluorophores intrinsèques (NADH, Acides aminés aromatiques + Acides nucléiques ou tryptophane) l'analyse de suspensions bactériennes préparées directement à partir de colonies permet d'obtenir plus de 90% de bonne classification pour des souches de référence même réparties en taxons proches. Cette méthode a permis, également, une identification aisée d'isolats et les résultats obtenus sont apparus cohérents avec ceux issus de PCR tout en apportant des informations complémentaires à ceux obtenus par identification sur galerie API 20 NE. LA méthode a été développée pour une lecture directe des colonies sur un milieu gélosé. Après différentes étapes de cadrage, la meilleure pertinence a été obtenue pour une lecture des colonies en fluorescence synchrone avec un décalage constant de 30 nm. L'analyse de la variance a montré une excellente répétabilité des résultats mais aussi des effets" position de la fibre optique vis à vis de la colonie" et durée d'incubation avant lecture (entre 48 et 72 heures) négligeables. Utilisée à des fins taxonomiques, la méthode s'est révélée très cohérente et complémentaire des méthodes relevant de la génomique. Elle permet d'analyser extrêmement rapidement et sans ajout de réactifs les proximités ou distance entre souches et de décrire les zones spectrales les plus identitaires. Enfin, nous avons aussi montré les potentialités de la spectroscopie de fluorescence pour la mise en place d'un outil de "traçabilité bactérienne" susceptible de répondre aux besoins des producteurs agroalimentaires dans leur démarche d'analyse des risques.
Fichier principal
Vignette du fichier
2009CLF21942.pdf (2.43 Mo) Télécharger le fichier
Loading...

Dates et versions

tel-00725447 , version 1 (24-09-2012)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00725447 , version 1

Citer

Belal Tourkya. Mise au point de la spectroscopie de fluorescence pour la taxonomie des Pseudomonads. Application à la caractérisation d'isolats d'ateliers carnés. Ingénierie des aliments. Université Blaise Pascal - Clermont-Ferrand II; Université d'Auvergne - Clermont-Ferrand I, 2009. Français. ⟨NNT : 2009CLF21942⟩. ⟨tel-00725447⟩
237 Consultations
3547 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More