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Thèse Année : 2011

Deubiquitinations in Notch signaling

Déubiquitinations dans la voie de signalisation Notch

Résumé

Notch signaling is a highly conserved pathway from Caenorhabditis elegans to Drosophila melanogaster or mammals. It is absolutely required from embryonic development, and it controls many different processes such as cell differentiation, cell fate decision, cell proliferation, stem cells maintenance or apoptosis. The signaling is based on the activity of Notch receptor, which is expressed as an heterodimeric transmembrane protein, and which is activated during intercellular contacts by the binding of its transmembrane ligands expressed by neighboring cells. Consequently to this activation, Notch undergoes two successive proteolytic cleavages, respectively catalyzed by an ADAM metalloprotease and the γ-secretase complex. This last cleavage releases Notch intracellular domain in the cytoplasm, then this activated form is translocated to the nucleus where it finally directly promotes Notch target genes transcription by binding its transcription co-factors CSL and Mastermind. Notch receptor is regulated at several steps by ubiquitination processes : activated Notch monoubiquitination controls its γ-secretase cleavage, non-activated Notch polyubiquitination controls its lysosomal degradation. Ubiquitination processes are reversed by deubiquitination events. No deubiquitination step has been highlighted in Notch signaling yet. My thesis project consisted in identifying the deubiquitinating enzymes - the enzymes responsible for deubiquitination - involved in both ubiquitination processes previously described. To this end, we set up two immunofluorescence screens to test an shRNA library targeting each one of the 91 known or putative deubiquitinating enzymes of the human genome. The first screen allowed me to identify eIF3f, known so far as a subunit of the translation initiation factor 3, as a new protein carrying a deubiquitinating activity. eIF3f is recruited to activated Notch via the E3 ubiquitin ligase Deltex, and eventually enhances Notch signaling by deubiquitinating the activated receptor before the γ-secretase cleavage, thus triggering the production of transcriptionally active Notch. In addition, the second screen identified several candidate deubiquitinating enzymes, whose role in non-activated Notch intracellular trafficking is being validated.
La signalisation Notch est une voie extrêmement conservée depuis Caenorhabditis elegans jusqu'aux mammifères en passant par Drosophila melanogaster. Elle est requise dès le développement embryonnaire et contrôle de nombreux processus comme la différenciation et le choix du destin cellulaire, la prolifération, ou encore le maintien de stocks de cellules souches et l'apoptose. La voie est basée sur l'activité du récepteur Notch, un hétérodimère transmembranaire qui est activé lors de contacts intercellulaires par la liaison de ses ligands qui sont également des protéines transmembranaires. Suite à cette activation, le récepteur subit une série de deux clivages protéolytiques internes, respectivement catalysés par une métalloprotéase ADAM et par le complexe multi-protéique γ-secrétase. Ce dernier clivage libère le domaine intracellulaire de Notch dans le cytoplasme, cette forme étant ensuite transportée dans le noyau où elle active directement la transcription des gènes cibles de la voie Notch en se liant à ses co-facteurs de transcription, CSL et Mastermind. Le récepteur Notch est régulé à diverses étapes par des processus d'ubiquitination : la monoubiquitination du récepteur Notch activé contrôle son clivage γ-secrétase, la polyubiquitination du récepteur Notch non activé et endocytosé contrôle sa dégradation dans les lysosomes. Les processus d'ubiquitination sont réversiblement contrôlés par la déubiquitination. Or, aucune déubiquitination n'a été identifiée dans la voie de signalisation Notch. Mon projet consistait à identifier les déubiquitinases - les enzymes responsables de la déubiquitination - impliquées dans les deux processus d'ubiquitination décrits précédemment. Nous avons pour cela mis au point deux cribles en immunofluorescence permettant de tester une banque de shRNA qui cible l'expression des 91 déubiquitinases connues ou putatives du génome humain. Le premier crible m'a permis d'identifier eIF3f, une sous-unité du facteur d'initiation de la traduction eIF3, comme une nouvelle protéine portant une activité déubiquitinase. eIF3f est recrutée au récepteur Notch via l'E3 ubiquitine ligase Deltex, et régule positivement la voie de signalisation Notch en déubiquitinant le récepteur Notch activé avant le clivage γ-secrétase, favorisant ainsi la production de la forme transcriptionnellement active de Notch. Par ailleurs, le deuxième crible a identifié plusieurs déubiquitinases candidates, dont le rôle dans la régulation du trafic intracellulaire du récepteur Notch non activé est en cours de validation.
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Dates et versions

tel-00726110 , version 1 (28-08-2012)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00726110 , version 1

Citer

Julien Moretti. Déubiquitinations dans la voie de signalisation Notch. Biologie cellulaire. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00726110⟩
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