Study of a voltage-gated ion channel reconstituted in Giant Unilamellar Vesicles - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2011

Study of a voltage-gated ion channel reconstituted in Giant Unilamellar Vesicles

Sophie Aimon
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 930706

Résumé

Studying the role of the membrane in cell excitability is challenging using cells because of the homeostatic feedbacks preventing the external control of the relevant parameters. To circumvent these difficulties, I developed a model system in which a voltage-gated channel was reconstituted in a membrane where the composition, tension and geometry can be controlled. I thus expressed, purified and fluorescently labeled KvAP, a voltage-gated potassium channel. I then adapted a method to reconstitute the channel in Giant Unilamellar Vesicles, which are liposomes the same size as cells. I used quantitative confocal microscopy to measure the channel density in these GUVs (it can be controlled between few to thousands proteins per square micron). Furthermore, electrophysiology measurements showed that the protein is still functional after reconstitution. With these GUVs containing reconstituted KvAP, I have studied the affinity of the protein for curved membranes. I have pulled membrane nanotubes of controlled diameter from GUVs and measured the density of the protein in the tube as compared to the vesicle using confocal microscopy. I found that the channel is enriched in the nanotube and that this enrichment increases as a function of curvature, in agreement with an elasticity based theory. The second application was the study of the effect of membrane confinement on KvAP diffusion. Using single particle tracking, we found that the diffusion coefficient decreases by a factor 3 when the tube radius decreases from 250 to 10 nm. This result is in agreement with a hydrodynamic theory that extends the work of Saffman and Delbrück to cylindrical geometries.
Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J'ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j'ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J'ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J'ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d'électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m'a permis d'étudier tout d'abord l'affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j'ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j'ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J'ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l'élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l'effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d'un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique.
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Dates et versions

tel-00736743 , version 1 (01-11-2012)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00736743 , version 1

Citer

Sophie Aimon. Study of a voltage-gated ion channel reconstituted in Giant Unilamellar Vesicles. Biological Physics [physics.bio-ph]. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2011. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00736743⟩
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