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!. !. Constructions, P. Ac-chi, and 9. , 2! 1.! Amorces et produits 5! 3.! Conditions des PCR sur colonies, 11! C.! Protéines recombinantes dans les cellules HEK

D. Analyses, B. Dosage, B. La-fluorocilline?, and .. , 17! 1 17! 3

L. Tm, ADN est sous forme double brin et 50% sous forme simple brin Au cours de l'amplification, il y a deux séries de cycles alors que classiquement il en suffit d'un. La première série de cycles permet d'optimiser la réaction En effet la présence des bouts flottants sur les amorces, contenant des séquences non présentes sur la matrice dans le but d'ajouter des sites cibles d'enzymes de restrictions, empêche une parfaite hybridation. Le fait d'utiliser une température plus basse que celle du Tm augmente l'efficacité de l'amplification en favorisant l'hybridation des amorces, malgré la présence de ces bouts flottants. Mais pour limiter l'amplification de séquences non spécifiques, du fait de se placer à un Tm plus bas, cette première série d'amplification se limite à 10 cycles. Lors des 30 cycles suivants, la température est augmentée pour se rapprocher de celle du Tm du couple d'amorces. Ces deux températures d'hybridation sont représentées en gras dans le tableau, Celles indiquées ici correspondent au couple d'amorces utilisé dans l'amplification du scFv 9G4H9 pour un clonage dans le vecteur pSecTag2C PCR : !"#$%$ &'()*+$µ

!. ". K1-'l90, ;$E#FF4?$)8G$$6)+,9%$%HI'7$F&A, pp.54-60

. Lb-agar, tryptone 1%, extrait de levure 1%, NaCl 10 mM, 2% agar et un antibiotique pour sélectionner les bactéries ayant intégré le plasmide d'intérêt

. Vecteurs, ? pSecTag2C/scFv9G4H9 pour l'expression du scFv 9G4H9. ? pFUSE-HC/V H 9G4H9 et pFUSE-LC/V L 9G4H9 pour l'expression de l'anticorps 9G4H9 chimérique entier

. Le-jour-de-la-transfection, ? Le milieu DMEM est remplacé par de l'OptiMEM 2h avant la transfection Ce milieu permet de diminuer la concentration en sérum à 2% sans conséquence néfaste sur les cellules. Ceci permet d'optimiser la purification de la protéine recombinante d'intérêt

B. Kit, Sigma-Aldrich): solution A d'acide bicinchoninic, solution B de sulfate de cuivre (ratio d'utilisation A/B de 50:1)

. Spectrophotomètre, Microplaque 96 puits (Greiner)

L. Capacité-de-catalyse-de-l, AC chi 9G4H9 ou de son dérivé scFv est révélée par l'hydrolyse d'un substrat fluorogénique. Ce substrat n'émet de la fluorescence qu'en cas d

. Les-constantes-d, affinité sont déterminées grâce au logiciel BIAcore T100 evaluation en choisissant le modèle d'interaction Langmuir (response vs. concentration). L'alignement des résultats a été réalisé