Magic-angle Spinning NMR of paramagnetic metalloproteins - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2018

Magic-angle Spinning NMR of paramagnetic metalloproteins

RMN en rotation à l’angle magique de métalloprotéines paramagnétiques

Résumé

Most of our understanding of metalloproteins derives from atomic or molecular structures obtained from diffraction methods on single crystal samples. However, not all proteins are amenable for diffraction studies, and even when a highly-resolved structure is available, often the nature of the metal ion, its coordination geometry or its oxidation state are not determined. The aim of the present thesis is the investigation of structural properties of metal sites in paramagnetic metalloproteins by Magic-Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance (MAS NMR). MAS NMR is a powerful technique for the investigation of biological systems, and may represent a direct probe of the structure at the active site of paramagnetic metalloproteins. However, it suffers from limited sensitivity and resolution when applied to nuclei close to a paramagnetic center.In this thesis, we address these limitations by developing NMR methods based on ultra-fast (60-111 kHz) MAS rates. A “toolkit” of suitably designed pulse sequences is built for the detection and the assignment of nuclei in close proximity of a paramagnetic center. State-of-the-art computational techniques are also employed to convert the experimental data into structural restraints for obtaining atomic-resolution geometries of active sites. We benchmark this approach with the study of Fe, Cu and Co sites in two microcrystalline proteins, and we also provide preliminary data on a non-diffracting divalent metal ion transporter in lipid membranes. We anticipate that the techniques described here are an essential tool to elucidate many currently unanswered questions about structure and function of metal sites in structural biology.
À ce jour, nos connaissances sur les propriétés structurales et fonctionnelles des métalloprotéines sont essentiellement basées sur des structures résolues par des méthodes de diffraction à rayons X appliquées à des échantillons monocristallins. Cependant, certaines protéines ne cristallisent pas ou cristallisent sous une forme qui n’est pas manipulable ou compatible avec des techniques des diffraction, et même si une structure à très haute résolution est disponible, la nature de l’ion métallique, sa géométrie de coordination ou son état d’oxydation restent souvent indéterminés.La Résonance Magnétique Nucléaire en rotation à l’angle magique (MAS NMR) est une technique très performante pour l’étude de systèmes biologiques et pour la caractérisation de la structure du site actif des métalloprotéines paramagnétiques, mais son application à l’analyse des noyaux proches d’un site paramagnétique est limitée à cause de la résolution et de la sensibilité faibles.L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes RMN basées sur des hautes fréquences de rotation (60-111 kHz MAS) pour faire face à ces problématiques. Un répertoire de séquences d’impulsion pour la détection et l’attribution des noyaux à proximité d’un centre paramagnétique est proposé, et à l’aide de méthodes de calculs de pointes, les données expérimentales acquises sont converties en contraintes structurales afin de déterminer la géométrie du site actif à l’échelle atomique. Cette approche est validée avec l’analyse de sites actifs de deux protéines microcristallines contenants différents ions paramagnétiques : Fe, Cu et Co. Ensuite, des données préliminaires sur un transporteur membranaire d’ions métalliques divalents non cristalline sont présentées.Les méthodes analytiques présentées ici constituent un ensemble d’outils indispensable pour l’élucidation de la structure et la fonction des sites métalliques de systèmes macromoléculaires biologiques.
Fichier principal
Vignette du fichier
BERTARELLO_Andrea_2018LYSEN004_These.pdf (127.32 Mo) Télécharger le fichier
Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-02092006 , version 1 (07-04-2019)
tel-02092006 , version 2 (09-04-2019)

Identifiants

  • HAL Id : tel-02092006 , version 2

Citer

Andrea Bertarello. Magic-angle Spinning NMR of paramagnetic metalloproteins. Other. Université de Lyon, 2018. English. ⟨NNT : 2018LYSEN004⟩. ⟨tel-02092006v2⟩
190 Consultations
30 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More