Optimisation du suivi de l'exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques pendant la grossesse avec le développement et la validation de méthodes analytiques et biologiques - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

Optimization of the monitoring of PAH exposure during pregnancy with the development and validation of analytical and biological methods

Optimisation du suivi de l'exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques pendant la grossesse avec le développement et la validation de méthodes analytiques et biologiques

Résumé

Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) are mainly emitted by human activities and are one of the main pollutant groups in air, soils, waters, and food. Therefore, they are subject to atmospheric, environmental and food monitoring. This study focuses on the particular case of exposure of pregnant women and their fetus, which are at risks. Indeed, PAH exposure can lead to fetal malformations, prematurity and even disorders in children and adult. To date, only a few PAHs regulated by US-EPA were searched and quantified in maternal or umbilical cord blood. Moreover, analytical performance data are often lacking. Hence, this study aims for the first time in France, at developing analytical and biological methods for the monitoring of PAH exposure during pregnancy. In a first part, the simultaneous determination of the 24 regulated PAHs in sera from maternal and umbilical cord bloods was developed. First, the analysis of the 24 PAHs by liquid chromatography and UV and fluorescence detections (HPLC-UV-FD) and by gas chromatography hyphenated to mass spectrometry (GC-MS) were optimized. The sample pretreatment of the plasma samples was next developed. The precipitation of the proteins present in the plasma was optimized with a Design of Experiment to disrupt all the interactions between them and the PAHs. A solid phase extraction (SPE) protocol, with a C18-based sorbent, was next optimized to extract and concentrate the PAHs. To improve the enrichment factors, the elution SPE fractions were next evaporated and 2 approaches were evaluated: a total or a partial evaporation ("last drop" method). The final analytical protocol involving the sample pretreatment followed by HPLC-UV-FD or GC-MS was successfully validated with spiked pooled sera from maternal and umbilical cord bloods with the accuracy profile approach. Then, sera samples from maternal and umbilical cord bloods were analyzed by LC/UV-FD and GC/MS. Finally, the previously developed analytical methods were used for a study with the ex vivo human cotyledon perfusion model. Perfusions were carried out for the first time with a mix of 14 US-EPA PAHs and their placental transfer was demonstrated. In addition, human trophoblast cell cultures with 1 µM with 14 US-EPA PAHs were carried out to evaluate the impact of PAH exposure on placental functions. The dysfunction of certain placental functions such as trophoblast fusion and differentiation, endocrine functions and detoxification functions was demonstrated.
Les Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques (HAP) sont principalement émis par les activités humaines et représentent l'un des principaux groupes de polluants dans l'air, les sols, les eaux et les aliments. Par conséquent, ils font l'objet d'une surveillance atmosphérique, et alimentaire. Cette étude s'attache au cas particulier de la femme enceinte et son fœtus. En effet, l'exposition pendant la grossesse est à l'origine de malformations fœtales, de prématurité et de troubles pouvant survenir ensuite chez l'enfant mais aussi chez l'adulte. À ce jour, seuls quelques HAP réglementés par l'environnement ont été recherchés et quantifiés dans le sang maternel ou le sang de cordon ombilical. De plus, les données sur les performances analytiques sont souvent manquantes. Ainsi ce projet vise pour la première fois en France à développer et valider des méthodes analytiques et biologiques pour la surveillance de l'exposition aux HAP durant la grossesse. Dans une première partie, la quantification simultanée des 24 HAP réglementés dans les sérums de sang maternel et de sang de cordon ombilical a été développée. Tout d'abord, l'analyse des 24 HAP par chromatographie en phase liquide et par détections UV et fluorescence (HPLC-UV-FD) et par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS) a été optimisée. Le prétraitement des échantillons de sérum a ensuite été développé. La précipitation des protéines présentes dans le sérum a été optimisée avec un plan d'expérience afin d'interrompre toutes les interactions entre les protéines et les HAP. Un protocole d'extraction sur phase solide (SPE), avec un supportt à base de silice greffée C18, a ensuite été optimisé pour extraire et concentrer les HAP. Pour améliorer les facteurs d'enrichissement, les fractions d'élution de SPE ont ensuite été évaporées et 2 approches ont été évaluées: une évaporation totale ou partielle (méthode "dernière goutte"). Le protocole analytique final impliquant la préparation d'échantillon suivi par l'analyse en HPLC-UV-FD ou GC-MS a été validé avec succès à partir d'un mélange de sérums maternels dopés et un mélange de sérums dopés provenant de sangs de cordons ombilicaux avec l'approche des profils d'exactitude. Ensuite, des échantillons de sérum provenant de sang maternel et de sang de cordon ombilical ont été analysés par HPLC-UV-FD et GC-MS. Enfin, les méthodes analytiques développées précédemment ont été utilisées pour l'étude du transfert placentaire des HAP avec le modèle de perfusion du cotylédons humains ex vivo. Les perfusions ont été réalisées pour la première fois avec un mélange de 14 HAP (concentration totale : 1 microM) et leur transfert placentaire a été démontré. De plus, des cultures cellulaires de trophoblastes humains exposées avec ce mélange de 14 HAP (concentration totale : 1 microM) ont été réalisées pour évaluer l'impact de l'exposition aux HAP sur les fonctions placentaires. Le dysfonctionnement de certaines fonctions placentaires telles que la fusion et la différentiation des trophoblastes, les fonctions endocrines et les fonctions de détoxifications.
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Dates et versions

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Identifiants

  • HAL Id : tel-02538673 , version 1

Citer

Stéphanie Swiha. Optimisation du suivi de l'exposition aux hydrocarbures aromatiques polycycliques pendant la grossesse avec le développement et la validation de méthodes analytiques et biologiques. Gynécologie et obstétrique. Université Sorbonne Paris Cité, 2019. Français. ⟨NNT : 2019USPCB020⟩. ⟨tel-02538673⟩
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