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Thèse Année : 2020

Regulation of Netrin-1 by p53 isoforms

Régulation de la Nétrine-1 par les isoformes de p53

Résumé

Netrin-1, a secreted protein recently characterized as an innovative cancer therapeutic target, is the anti-apoptotic ligand of Deleted in Colorectal Cancer (DCC) and UNC5H family member receptors, belonging to the dependence receptor family. As Netrin-1 is strongly expressed in several aggressive cancers, by inhibiting cell death induced by its receptors, interference of the binding with its receptors has been shown to actively induce apoptosis and tumour regression. To this line, a monoclonal neutralizing anti-Netrin-1 antibody has been developed and it is currently in phase I clinical trial. Recently, it has been shown that the transcription factor p53 positively regulates Netrin-1 gene expression. Here we show that Netrin-1 up-regulation requires transcriptional activity of the second p53 transactivation domain. Moreover, we propose that Netrin-1 could be a new target gene of N-terminal p53 isoform D40p53, independently by full-length p53 activity. We demonstrate this hypothesis using stable cell lines, harbouring wild-type or null-p53, in which D40p53 expression could be finely tuned. Our results indicate that D40p53 is able to bind and activate Netrin-1 promoter, suggesting the formation of a D40p53 homo-tetramer complex. In addition, employing CRISPR/Cas9 method, we show here that forcing immortalized human skeletal myoblasts cells to produce D40p53 isoform, instead of full-length p53, leads to Netrin-1 and its receptor UNC5B up-regulation. As a consequence, cells increase Netrin-1 dependence to survival, allowing Netrin-1 inhibition to trigger apoptotic cell death. Finally, we clearly indicate a positive correlation between Netrin-1 and D40p53 gene expression in human melanoma and colorectal cancer biopsies. In conclusion, we propose here a pro-tumour role of D40p53 through direct activation of Netrin-1, independently to full-length p53 activity. Following dependence receptor notion, inhibition of Netrin-1 binding to its receptors, instead of targeting dominant-negative function, should be a promising therapeutic strategy in human tumours expressing high levels of D40p53
La nétrine-1 est une protéine sécrétée initialement découverte pendant le développement du système nerveux. Cependant, la nétrine-1 a récemment été impliquée dans la régulation de la tumorigenèse ; en effet, les principaux récepteurs de la Netrin-1, les membres de la famille DCC et UNC5H, appartiennent à la famille des récepteurs à dépendance. Ces récepteurs ont la particularité d'être également actifs en absence de leurs ligands, induisant une "signalisation négative" qui déclenche l'apoptose. Les récepteurs de dépendance sont des candidats suppresseurs de tumeurs. L'hypothèse générale est que ces récepteurs limitent le développement des tumeurs par l'induction de l'apoptose des cellules tumorales qui se développeraient ou migreraient au-delà des régions de disponibilité des ligands. Par conséquent, la transformation tumorale est associée à l'inhibition constitutive des signaux de mort induits par ces récepteurs, qui pourrait être réalisée, par exemple, par une régulation positive des ligands. En effet, un gain de nétrine-1 a récemment été décrit dans plusieurs cancers humains. Cependant, on sait peu de choses sur la régulation de l'expression de la Nétrine-1 pendant la tumorigènes. Nous avons récemment observé que le facteur de transcription p53 régule l'expression de la nétrine-1. p53 est un gène suppresseur de tumeur bien connu par sa capacité à réguler l'expression de différents gènes, impliqué dans plusieurs réponses cellulaires, y compris l'apoptose, l'arrêt du cycle cellulaire, la sénescence et le métabolisme. Pour mieux caractériser la régulation de la nétrine-1 par p53, nous avons d'abord vérifié que la régulation de la nétrine-1 nécessite de l’activité transcriptionnelle de p53, et nous avons identifié quel domaine de transactivation est nécessaire pour réguler la nétrine-1. De façon intéressant, au cours des dernières années, plusieurs isoformes alternatives de p53 ont été identifiées, produit par l'initiation alternative de la traduction, l'utilisation de promoteurs alternatifs et/ou l'épissage alternatif. En particulier, l’isoforme D40p53 présent le domaine de transactivation nécessaire pour la régulation de la nétrine-1 par p53. Notre hypothèse était donc que l’isoforme D40p53 est capable de réguler l’expression de la nétrine-1 et ainsi de son récepteur UNC5B. Pour ça, nous avons généré des lignées stables inductible pour D40p53. De cette façon, nous avons montré une augmentation de l’expression de la nétrine-1 et UNC5B suite à l’induction de D40p53, de façon autonome de la p53 entière. De plus, nous avons montré que D40p53 se lie directement au promoteur de la Netrin-1, en l’activant, sur la même séquence d’ADN que la p53 entière. Enfin, nous avons montré que aussi la production forcée endogène de l’isoforme D40p53 dans la lignée cellulaire de myoblastes humains immortalisés LHCN-M2 induit l’expression de la nétrine-1 et UNC5B. Aussi, nous avons montré dans ces cellules que l’inhibition de l’expression de la nétrine-1 est suffisant pour déclencher l’apoptose. Enfin, nous avons observé une corrélation positive entre l’expression de D40p53 et la nétrine-1 dans de biopsies de mélanomes et de tumeurs colorectales, confirmant que D40p53 pourrait être un biomarqueur des tumeurs à forte expression de la nétrine-1. En conclusion, nous montrons ici pour la première fois que l'isoforme D40p53, souvent exprimée dans les cellules tumorales, pourrait réguler positivement une protéine anti-apoptotique, comme la nétrine-1, d'une manière indépendante de la p53 entière
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03310180 , version 1 (30-07-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03310180 , version 1

Citer

Yan Sun. Regulation of Netrin-1 by p53 isoforms. Cellular Biology. Université de Lyon, 2020. English. ⟨NNT : 2020LYSE1058⟩. ⟨tel-03310180⟩
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