The exploitation of cell-free protein synthesis technologies for integrated structural biology - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

The exploitation of cell-free protein synthesis technologies for integrated structural biology

Exploitation de la technologie acellulaire pour des applications en biologie structurale intégrée

Résumé

Cell-free protein synthesis (CFPS) is an alternative method to cellular expression for recombinant protein production. Its lack of cellular boundaries enables direct modification of the CFPS reaction to allow optimised and rapid production of functional and labelled proteins. The aim of this industry-funded PhD was to demonstrate the applicability of the Synthelis CFPS technology for integrated structural biology by showing that CFPS proteins were functionally and structurally equivalent to those from in vivo expression systems.These objectives were addressed with analytical approaches to the production and testing of different lysates used in the CFPS reactions and the use of model proteins for CFPS production and purification, and biophysical and structural analyses. The model proteins studied were the GPCR (G-protein coupled receptor) CXCR4 (CXC motif chemokine receptor 4) and its soluble ligand SDF1-α (stromal cell-derived factor alpha-1), and the membrane protein CD4 (cluster of differentiation 4) and its truncated soluble variant 2dCD4. CXCR4 and SDF1-α are essential in the chemotaxis of cells, and CD4 plays a critical role in immune response. Pathologically, CXCR4/SDF1-α are involved in cancer progression, and CD4 is the primary receptor for HIV GP120 (glycoprotein 120) during viral infection.For the purposes of integrated structural biology, a primary objective was to optimise CFPS to generate sufficient amounts of protein. From a screen of CFPS lysates derived from several E. coli strains, it was determined that Rosetta lysate enhanced yields of CXCR4. High cell density cultures (HCDC) in fermenters were then established for lysate production. Subsequently, HCDC was used for the production of deuterated lysates for SANS (small-angle neutron scattering) studies.Full-length CXCR4 and CD4 were produced in proteoliposomes or additionally, for CXCR4, as detergent solubilised protein. However, the expression and purity levels of solubilised CXCR4 and CD4 remained too low to permit advanced structural work. Nevertheless, soluble and functional SDF1-α and 2dCD4 were produced using lysate obtained from the SHuffle E. coli strain, which promotes disulphide bond pairing. CFPS is therefore advantageous over in vivo expression, where these occur as insoluble proteins and require an intensive refolding procedure. Subsequently, CFPS was established as a method for the rapid production of deuterated SDF1-α and 2dCD4.The CFPS-generated proteins were assessed using biophysical techniques. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) and SPR (surface plasmon resonance) analyses of CXCR4 in proteoliposomes using conformational antibodies indicated binding and, therefore, a proper folding. Additionally, CD4 functionality in proteoliposomes was confirmed by using GP120 and conformational antibodies in ELISAs. Mass spectrometry of SDF1-α and its deuterated forms confirmed disulphide bonding and deuteration levels. The functionality of SDF1-α variants were confirmed using chemotaxis assays. With a view to long-term optimisation of CFPS, CXCR4 proteoliposomes were assessed using a NanoSightTM particle tracker, which provided insights into the changes in size and size distribution of proteoliposome particles during the CFPS reaction.Advanced structural studies were performed on SDF1-α and 2dCD4. Structural determination of CFPS generated SDF1-α by X-ray crystallography showed that it was identical to that of the published E. coli refolded form. The preliminary SANS assessment of deuterated 2dCD4 in complex with GP120 provided initial confirmation of the success of CFPS produced protein to provide viable SANS data. Finally, a SANS feasibility study indicated the possibility of obtaining structural information about model proteins despite in the presence of unfractionated lysates. This novel technique could lead to the characterisation of CFPS membrane proteins in proteoliposomes, following a partial purification step.
La synthèse des protéines acellulaire/«cell-free» (cell-free protein synthesis, CFPS) est une méthode alternative à l'expression in vivo pour la production de protéines recombinantes. L’absence de barrières cellulaires permet de modifier aisément la réaction CFPS afin d’optimiser le rendement d’expression de la protéine et de favoriser son marquage. Le but de cette thèse était de démontrer que la technologie CFPS de Synthelis permet de produire des protéines de qualité, fonctionnellement et structurellement équivalentes à celles produites dans des systèmes in vivo.L’optimisation du CFPS et de la purification ont été abordées avec des protéines modèles : le RCPG (récepteur couplé à la protéine G) CXCR4 (récepteur de chimiokine de type C-X-C), son ligand naturel soluble SDF1-α(facteur 1 de cellule stromale), la protéine membranaire CD4 (cluster of differentiation 4), et la forme soluble et tronquée de CD4, 2dCD4. CXCR4 et SDF1-α sont essentiels dans la chimiotaxie des cellules, et CD4 joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire. CXCR4 et SDF1-α sont impliquées dans la progression du cancer, tandis que le CD4 sert de récepteur primaire pour GP120 (glycoprotéine 120) du VIH pendant la phase d’infection.Grace à un criblage de lysats dérivés de plusieurs souches d'E. Coli, il a été montré que le lysat de Rosetta était le plus adapté pour produire CXCR4. Par la suite, des cultures à haute densité cellulaire en fermenteur ont été réalisées pour la production du lysat. Ainsi, les protocoles de culture en fermenteur ont été adaptés pour la production de lysats deutérés. Ces lysats ont été utilisés pour des études de diffusion de neutrons aux petits angles (small-angle neutron scattering, SANS).Ensuite, les protéines CXCR4 et CD4 ont été produites dans des protéoliposomes. De plus, CXCR4 a été produite sous forme solubilisée avec un détergent. Cependant, les niveaux d'expression et de pureté de ces deux protéines sont restés trop faibles pour permettre une caractérisation structurale. Néanmoins, en utilisant du lysat obtenu à partir de la souche SHuffle d’E. coli qui favorise les ponts disulfures, les molécules SDF1-α et 2dCD4 ont été produites sous forme solubles et fonctionnelles. Le CFPS est donc avantageux par rapport à l'expression in vivo qui ne permet pas une expression de ces molécules sous forme soluble. De plus, le CFPS a permis la production deutérée de ces deux protéines.Les protéines CFPS ont ensuite été évaluées à l'aide de techniques biophysiques. Grâce à des analyses par ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) and SPR (surface plasmon resonance) la liaison spécifique entre des protéoliposomes CXCR4 et des anticorps conformationnels ont été validée. Des analyses similaires ont montré la liaison entre GP120 et des protéoliposomes CD4. La spectrométrie de masse sur la molécule SDF1-α et sur ses formes deutérées a confirmé les niveaux de deutération, et la formation des ponts disulfures. La fonctionnalité de SDF1-α a été confirmée par des tests de chimiotaxie. Enfin, une étude avec le traqueur de particules NanoSightTM sur les protéoliposomes CXCR4, a permis de mieux comprendre les changements de tailles et de la distribution des protéoliposomes au cours de la réaction CFPS.Finalement, des études structurales ont été réalisées avec SDF1-α et 2dCD4. SDF1-α a été cristallisée et caractérisée avec de la diffraction aux rayons X, et a permis de démontrer que la protéine produite par CFPS était identique à celle obtenu in vivo. Ensuite, l'étude du complexe 2dCD4 deutéré et GP120 au SANS a fourni des résultats préliminaires sur l’application du CFPS pour le SANS. Enfin, une étude de faisabilité SANS a indiqué la possibilité d'obtenir des informations structurales sur les protéines modèles malgré la présence de lysats non fractionnés. Cette nouvelle technique pourrait conduire à la caractérisation des protéines membranaires produites par CFPS dans des protéoliposomes.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03367493 , version 1 (06-10-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03367493 , version 1

Citer

Vinesh Mervyn Jugnarain. The exploitation of cell-free protein synthesis technologies for integrated structural biology. Chemical Physics [physics.chem-ph]. Université Grenoble Alpes, 2019. English. ⟨NNT : 2019GREAV078⟩. ⟨tel-03367493⟩

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