CE platform for assaying enzymatic activity and modulation : application to lipases and nucleoside kinases
Suivi du l’activité enzymatique et de sa modulation par CE : application à l’étude des lipases et nucléosides kinases
Abstract
Capillary electrophoresis (CE) has shown promising potential to be used as a complementary or an alternative technique to conventional techniques for several pharmaceutical and therapeutic applications. One of the most significant applications of CE is that of screening for enzyme modulating drug candidates. This thesis was set to demonstrate the analytical and technical power of CE as for monitoring enzymatic reactions in the absence or presence of natural or synthetic modulators. Both offline and online transverse diffusion of laminar flow profiles (TDLFP) reaction modes were adopted for mixing the different reactants. Additionally, several techniques for analyte detection such as UV, C4D and MS, were hyphenated to CE and used for assaying the activities and regulation of model enzymes, mainly lipases and nucleoside kinases. The modulatory molecules ranged in complexity from isolate, molecules purified from natural or synthesized chemically to complex plant extracts. Microscale thermophoresis (MST), a relatively novel biophysical technique used for evaluation of binding affinities between interacting partners (Kd), was used to investigate interactions between lipases and small ligands. The complementarity between the results from ligand binding and those from ligand modulation of enzymatic activity allow the construction of a more complete image of the molecular mechanism in which ligands bind and induce changes in the enzymatic activity. Biomolecular crowding was shown through an offline CE-based hyaluronidase assay to have a significant effect on the ability of purified molecules to inhibit hyaluronidase. Bioactivity assays of several plant extracts, using CE in addition to more conventional techniques revealed the benefit of using these extracts as herbal tea infusions given their anti-hyaluronidase, hypotensive and antioxidant properties. In addition to enzymatic assays, the application of CE, more specifically CE-HRMS, for metabolite detection in complex biological samples demonstrated enhanced repeatability upon using the effective mobility scale instead of the conventional migration time scale. Furthermore, a CE-MS based assay was developed and successfully applied to monitor the activity of nucleoside kinases and screen the activity of novel anti-viral substrates.
L'électrophorèse capillaire (CE) a montré un potentiel prometteur en tant que technique complémentaire ou alternative aux techniques conventionnelles pour divers applications pharmaceutiques et thérapeutiques. L'une des applications les plus intéressantes en CE est celle de la miniaturisation des criblages de candidats modulateurs des activités enzymatiques.Cette thèse visait à démontrer la puissance et la flexibilité de la CE pour le suivi des réactions enzymatiques en l'absence ou en présence de modulateurs naturels (extraits de plantes ou molécules naturelles purifiées) ou synthétiques. Les réactions en mode hors-ligne et en-ligne (diffusion transversale des profils d'écoulement laminaire ou TDLFP) ont été utilisés après optimisation. De plus, plusieurs techniques de détection telles que l’UV, le C4D et la SM, ont été utilisées pour l’étude des enzymes modèles à savoir les lipases et les nucléosides kinases en particulier. La thermophorèse à micro-échelle (MST), une technique biophysique relativement nouvelle, a également été utilisée pour l'évaluation des affinités de liaison entre les lipases et des petites molécules (Kd). La complémentarité entre les résultats de l’affinité moléculaire et ceux de la modulation de l'activité enzymatique obtenus par CE permet l’obtention d'une image plus complète du mécanisme moléculaire par lequel les ligands induisent des changements dans l'activité enzymatique. Par ailleurs, l’important effet de l’encombrement (bio)moléculaire a été démontré par un test de l’activité de l’hyaluronidase en EC. Les dosages de la bioactivité de plusieurs extraits de plantes, utilisant la CE ainsi que plusieurs techniques plus conventionnelles, ont révélé l'intérêt d'utiliser ces extraits sous forme d'infusions compte-tenu de leurs propriétés anti-hyaluronidase, hypotensives et antioxydantes. En plus des dosages enzymatiques, l'application de la CE, plus spécifiquement la CE-HRMS, pour la détection de métabolites dans des échantillons biologiques complexes a démontré une excellente répétabilité en utilisant l'échelle de mobilité effective au lieu de l'échelle de temps de migration conventionnelle. En outre, un test basé sur la CE-MS a été développé et appliqué avec succès pour surveiller l'activité des nucléoside kinases et cribler l'activité de nouveaux substrats antiviraux.
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