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Thèse Année : 2019

From skeletal muscle stem cells to tissue atlases : new tools to investigate and circumvent dissociation-induced stress

Des cellules satellites aux atlas tissulaires : nouvelles méthodes pour détecter et prévenir le stress induit par la dissociation

Résumé

Every cell in a multicellular organism is dynamically interacting with its microenvironment, which acts as a major regulator of its properties and gene-expression profile. However, most modern high-throughput molecular assays such as RNA-sequencing require the isolation of cells from their microenvironment. Such isolation procedures are often an order of magnitude longer than the time it takes for a cell to alter its molecular state – such as their gene-expression profile - in response to a stimulus.We developed a new procedure relying on aldehyde-fixation to preserve the in vivo transcriptome of isolated cells. Using quiescent skeletal muscle stem cells (MuSCs), we demonstrated that during dissociation they undergo unexpectedly broad transcriptional changes that initiate a cell fate transition from quiescence to activation. Moreover, we uncovered that MuSCs cell-cycle entry is mediated through MAPK ERK1/2 signalling, and uncoupled from MuSCs differentiation, which requires Notch signalling silencing. We also confirmed with complementary time-course strategies that MuSCs initiate a conserved transcriptional response to diverse stimuli as the signatures of ex vivo dissociation and in vivo activation were very similar, down to the single-cell level.To investigate the ubiquity of such dissociation-response we used single nuclei RNA-sequencing to generate transcriptional organ atlases from intact and dissociated skeletal muscle and liver and found - consistently with MuSCs - strong alterations across cell types and tissues. The majority of the modifications were cell type specific, yet we defined a core dissociation signature that revealed a high degree of distortion in published datasets, in a dissociation-time dependent manner. Overall, our study proposes that during isolation cells execute specialized genetic programs, which lead to cellular state alterations. Therefore, by using cells isolated with conventional methods the initiating events of cell transitions, like quiescence exit, are overlooked, and reference cell maps, like cell atlases, are fundamentally distorted.
Chaque cellule d’un organisme multicellulaire interagit dynamiquement avec son microenvironnement, ce dernier étant un régulateur majeur de ses fonctions et de son profil d’expression génique. Cependant, la plupart des analyses moléculaires à haut débit modernes comme le séquençage d’ARN nécessitent l’isolation des cellules de leur microenvironnement. Ces procédures d’isolation sont souvent un ordre de grandeur plus longues que le temps qu’il faut à une cellule pour altérer son état moléculaire - tel que son profil d’expression génique – en réponse à un stimulus. Nous avons développé une nouvelle procédure utilisant la fixation par aldéhyde pour préserver le transcriptome in vivo de cellules isolées. En utilisant les cellules souches du muscle strié squelettique (MuSCs), nous avons démontré que lors de la dissociation, ces dernières subissent des modifications transcriptionnelles d'une ampleur inattendue qui initient une transition de leur état cellulaire de la quiescence vers l'activation. De plus, nous avons découvert que l’entrée du cycle cellulaire des MuSCs est médiée par la signalisation MAPK ERK1/2 et découplée de la différenciation des MuSCs, qui nécessite l’extinction de la voie de signalisation Notch. Nous avons également confirmé par des stratégies complémentaires de cinétique temporelle que les MuSCs initient une réponse transcriptionnelle inchangée face à différents stimuli. En effet, les signatures de dissociation ex vivo et d'activation in vivo observées sont très similaires, même en séquençage de cellule unique. Pour étudier l'omniprésence d'une telle réponse à la dissociation, nous avons utilisé le séquençage d'ARN de noyau unique pour générer des atlas cellulaires à partir de muscle strié strié squelettique et de foie - intacts et dissociés - et avons trouvé, conformément aux MuSCs, de fortes et ubiquitaires modifications transcriptionnelles, au niveau cellulaire et tissulaire. La plupart des modifications étaient spécifiques pour chaque type cellulaire, mais nous avons cependant pu définir une signature de dissociation commune qui révèle un degré élevé de distorsion dans les jeux de données publiés dans la littérature, d’une manière corrélée au temps de dissociation de ladite cellule ou dudit tissu. Dans l’ensemble, notre étude propose ainsi que, pendant l’isolation, les cellules exécutent des programmes génétiques spécialisés qui entraînent des modifications de leur état cellulaire. Par conséquent, en utilisant des cellules isolées par des méthodes conventionnelles, les événements initiateurs des transitions d’état cellulaires, tels que la sortie de quiescence, sont ignorés et les jeux de données transcriptomiques de référence, comme les atlas cellulaires, sont fondamentalement déformés.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03471274 , version 1 (08-12-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03471274 , version 1

Citer

Léo Machado. From skeletal muscle stem cells to tissue atlases : new tools to investigate and circumvent dissociation-induced stress. Cellular Biology. Université Paris-Est, 2019. English. ⟨NNT : 2019PESC0080⟩. ⟨tel-03471274⟩
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