Développement d’outils analytiques pour l’analyse de biomarqueurs de longue durée de vie de l’ypérite dans les échantillons biologiques - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Development of analytical tools for the analysis of long-lived sulfur mustard biomarkers in biological samples

Développement d’outils analytiques pour l’analyse de biomarqueurs de longue durée de vie de l’ypérite dans les échantillons biologiques

Résumé

Sulfur mustard is a vesicant agent that can react with hemoglobin to form stable adducts used as long-lived biomarkers and that can be detected in the organism up to 120 days after exposure to the agent. Their analysis is mainly carried out by a sequencing procedure of the protein that only targets the adducts formed with the N-terminal valine residues of hemoglobin. However, this method is time-consuming and laborious and it may lack sensitivity and repeatability. Moreover, alkylation on the N-terminal valine residues only represents 1-2% of the total alkylation on hemoglobin, and the analysis of tryptic digests showed that other residues could also be alkylated. A new approach was thus developed for the retrospective detection of exposure to sulfur mustard, based on the development of a digestion step of the protein in vitro exposed to sulfur mustard, using a trypsin-based immobilized enzyme reactor (IMER) coupled on-line with the LC-MS/MS analysis of the alkylated peptides. This procedure allowed to identify five new adduction sites and proved to be repeatable and linear on the concentration range studied. After development and optimization of a procedure to extract hemoglobin from blood, the method was applied to the analysis of blood samples spiked with sulfur mustard. The total duration of the procedure is inferior to 7h against 2.5 days for the sample treatment alone with the conventional sequencing method. Alkylated peptides resulting from the exposure of blood samples to sulfur mustard at 14 ng.mL-1 were detected, thus highlighting the sensitivity of the method, and the main adduction sites of sulfur mustard on hemoglobin in the biological matrix were identified.
L’ypérite est un agent vésicant pouvant réagir avec l’hémoglobine pour former des adduits stables utilisés comme biomarqueurs de longue durée de vie et pouvant être détectés jusqu’à 120 jours dans l’organisme. Leur analyse est principalement réalisée par une procédure de séquençage qui cible uniquement les adduits formés avec les valines N-terminales de l’hémoglobine, procédure laborieuse et chronophage pouvant manquer de sensibilité et de répétabilité. De plus, l’alkylation sur les valines N-terminales ne représente que 1 à 2% de l’alkylation totale et l’analyse de digestats tryptiques a démontré que d’autres résidus pouvaient être alkylés. Une nouvelle approche analytique, basée sur le développement d’une étape de digestion de la protéine exposée in vitro à l’ypérite sur un réacteur enzymatique immobilisé (IMER) à base de trypsine, couplé en ligne avec l’analyse des peptides alkylés par LC-MS/MS, a donc été développée pour confirmer une exposition à l’ypérite. Cette méthode a permis d’identifier cinq nouveaux sites d’adduction et s’est avérée répétable et linéaire sur la gamme de concentration étudiée. Après optimisation d’une procédure d’extraction de l’hémoglobine du sang, la méthode a été appliquée à l’analyse d’échantillons dopés à l’ypérite. La durée totale de la procédure est inférieure à 7h contre 2,5 jours pour l’étape de préparation des échantillons seule avec la méthode de séquençage usuelle. Des peptides alkylés résultant de l’exposition du sang à une teneur en ypérite de 14 ng.mL-1 ont pu être détectés, soulignant ainsi la sensibilité de la méthode, et les sites préférentiels d’adduction de l’ypérite sur l’hémoglobine en milieu biologique ont été identifiés.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03481991 , version 1 (15-12-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03481991 , version 1

Citer

Florine Hallez. Développement d’outils analytiques pour l’analyse de biomarqueurs de longue durée de vie de l’ypérite dans les échantillons biologiques. Biochimie [q-bio.BM]. Sorbonne Université, 2021. Français. ⟨NNT : 2021SORUS137⟩. ⟨tel-03481991⟩
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