Investigation of Caenorhabditis elegans transcriptome using nanopore-based sequencing technology - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2020

Investigation of Caenorhabditis elegans transcriptome using nanopore-based sequencing technology

Etude du transcriptome de Caenorhabditis elegans par la technique de séquencage nanopore

Résumé

A recent meta-analysis of alternative exon usage in C. elegans refined our comprehension of its transcriptome, especially regarding the splicing quantitative aspects of alternative splicing in messenger RNAs. However, Next-Generation Sequencing technologies like Illumina technology are proving to be limited to fully characterize one’s transcriptome. PCR-based sequencing methods are known to introduce amplification bias affecting the overall distribution of mRNAs detected in one experiment and short-reads are not suited to accurately predict the frequency of isoforms derived from multiple alternative splicing events.In this study, we exploited new possibilities offered by Oxford Nanopore Technology (ONT) to overcome those limitations. Nanopore-based sequencing allow us to directly sequence nucleic acids without any prior amplification step and generates long-reads covering up to the full-length of the molecule. Hence, permitting to further characterize C. elegans transcriptome by providing a more accurate measure of isoforms ratios, a better comprehension of exons associations during alternative splicing and by characterizing differentially trans-spliced mRNAs.We assessed the efficiency of different sequencing kits commercialized by ONT and our results indicates that direct-cDNA sequencing is better suited for performing transcriptome analysis in C. elegans, in regard to the quantity and quality of data generated. Following this analysis, several direct-cDNA sequencing experiments have been performed on different populations of mRNAs: libraries of poly(A) RNAs representing the whole-animal transcriptome and libraries of SL1-enriched mRNAs. Our findings indicates that trans-spliced RNAs have an atypical behaviour during ONT’s library preparation and trans-splicing of C. elegans mRNAs is more prevalent than previously reported. Finally, we also show that alternative promoters can lead to population of isoformes exhibiting different trans-splicing status.
Une récente méta-analyse de l’utilisation des jonctions exon-exon chez C. elegans nous a permis d’améliorer notre compréhension de son transcriptome, en particulier pour la quantification des événements d’épissage alternatif au sein des ARNs messagers. Cependant, les technologies de séquençage NGS, comme l’Illumina, se montrent limitées pour l’étude des transcriptomes. Ces technologies, basées sur la PCR, entraînent l’apparition de biais d’amplifications qui affectent la distribution des ARNms détectés au sein d’une expérience, et la petite taille des fragments générés n’est pas adapté pour correctement déterminer la fréquence des isoformes issus des différents événements d’épissage alternatifs.Dans cette étude, nous avons utilisé les nouvelles possibilités offertes par les séquenceurs Oxford Nanopore Technology (ONT) pour nous affranchir de ces limitations. Le séquençage nanopore nous permet de séquencer directement des molécules d’acides nucléiques sans avoir recours à des étapes d’amplification, et permet de générer des fragments pouvant couvrir la taille totale de la molécule séquencée. Ceci nous permettant de mieux caractériser le transcriptome de C. elegans, en effectuant une mesure plus précise des fréquences d’isoformes, et en nous permettant une meilleure compréhension des événements d’épissage alternatif et de trans-épissage qui affectent les messagers.Nous avons évalué trois différents kits de séquençage commercialisés par ONT et nos résultats suggèrent que le kit de séquençage direct-cDNA est plus adapté aux études de transcriptomes, en termes de quantité et de qualité de données générées. À la suite de cette analyse, plusieurs séquençages direct-cDNA ont été réalisés sur différentes populations d’ARNs : des librairies d’ARNs poly(A) représentants le transcriptome entier de C. elegans, et des librairies enrichies en ARNs SL1. Nos résultats indiquent que les ARNs trans-épissés se comportent différemment lors de la préparation des librairies ONT et que les phénomènes de trans-épissage sont plus prédominants que précédemment rapporté. Enfin, nous montrons que les promoteurs alternatifs peuvent conduire à la génération de populations d’isoformes présentant différents statuts de trans-épissage.
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Dates et versions

tel-03482198 , version 1 (15-12-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03482198 , version 1

Citer

Florian Bernard. Investigation of Caenorhabditis elegans transcriptome using nanopore-based sequencing technology. Human health and pathology. Université de Bordeaux; Tel Aviv university, 2020. English. ⟨NNT : 2020BORD0287⟩. ⟨tel-03482198⟩
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