Réseaux de protéines associés aux récepteurs de la sérotonine : rôle et options thérapeutiques pour la Maladie d'Alzheimer - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2020

Protein networks associated with serotonin receptors : role and therapeutic options for Alzheimer's Disease.

Réseaux de protéines associés aux récepteurs de la sérotonine : rôle et options thérapeutiques pour la Maladie d'Alzheimer

Résumé

Alzheimer’s Disease is the most common form of dementia worldwide and has become a major public health problem. This pathology is characterized by the presence of two main features in the brain: neurofibrillary tangles (NFTs) composed of hyperphosphorylated Tau and amyloid plaques, dense aggregates of hydrophobic β-amyloid peptide (Aβ). Aβ peptide results from the amyloidogenic degradation of the Amyloid Precursor Protein (APP) by β- and ɣ-secretases. On the other hand, the non-amyloidogenic proteolysis of APP, within the Aβ sequence by an α-secretase (mainly ADAM10), releases the extracellular fragment of APP (sAPPα), which is neurotrophic and neuroprotective. The 5-HT4 receptor (5-HT4R) is a G protein coupled receptor (GPCR) which interacts with APP and ADAM10, modulates their trafficking and maturation, and which pharmacological activation promotes the non-amyloidogenic cleavage of APP. The 5-HT6 receptor (5-HT6R) is another serotoninergic receptor which pharmacological modulation induces pro-cognitive effects. Thus, 5-HT4R and 5 HT6R constitute interesting therapeutic targets in the context of Alzheimer’s Disease. Nevertheless, the molecular and cellular mechanisms underlying these effects linked to 5-HT4R expression and activation remain elusive. This thesis aimed, in a first part, to develop a screening technique to isolate nanobodies (single domain antibody fragment from camelids) directed against 5-HT4R and 5 HT6R, by using TR FRET and flow cytometry approaches. In a second part, the use of a proteomic approach combining affinity purification of 5-HT4R partner proteins followed by their systematic identification by mass spectrometry (AP-MS) lead to the identification of potential partner proteins associated with 5-HT4R in HEK-293N cells. Amongst proteins recruited by 5 HT4Rs, we identified IRS4 (Insulin Receptor Substrate 4) protein. IRS4 protein is a transducer of the insulin signaling pathway. Given that a dysregulation of the insulin signaling pathway is one of the major events involved in Alzheimer’s Disease development, we decided to focus on this partner. We validated the interaction by Western blotting and showed a colocalization of endogenous IRS4 with 5 HT4R in HEK 293 cells. Then, functional studies showed that IRS4 downregulation induced 5 HT4R overexpression in HEK-293 cells, associated with an increase in the canonical signaling of the receptor through its Gs protein pathway.These results suggest a modulation of 5-HT4R trafficking and of its associated complex including APP and ADAM10 by IRS4 protein. This thesis work reveals for the first time a functional link between 5-HT4R signaling and insulin signaling pathway via IRS4 protein which could be of interest in the context of Alzheimer’s disease. It also establishes the preliminary basis for a fast identification of nanobodies targeting 5-HT4 and 5-HT6 receptors for which immunohistological tools are lacking to explore their underlying mechanisms.
La maladie d’Alzheimer, principale forme de démence dans le monde, est devenue un problème de santé publique majeur. Cette pathologie est caractérisée par la présence de deux lésions principales dans le cerveau : la dégénérescence neurofibrillaire composée de protéine Tau hyperphosphorylée et des plaques amyloïdes, agrégats denses de peptides β amyloïdes (Aβ). Le peptide Aβ provient du clivage de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) par des β- et ɣ-sécrétases. Un clivage dit non-amyloïdogène de l’APP existe également, au cours duquel la protéine est clivée par une α-sécrétase (principalement ADAM10) ce qui conduit à la production d'un fragment extracellulaire connu pour être neuroprotecteur et neurotrophique, le sAPPα. Le récepteur sérotoninergique 5-HT4 est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG) qui interagit avec l’APP et ADAM10, module leur trafic et leur maturation, et dont l’activation pharmacologique favorise le clivage non-amyloïdogène de l’APP. Le récepteur 5-HT6 est un autre récepteur sérotoninergique dont la modulation pharmacologique induit des effets pro-cognitifs. Les récepteurs 5-HT4 et 5-HT6 apparaissent donc comme des cibles thérapeutiques d'intérêt dans le contexte de la maladie d’Alzheimer. Néanmoins, les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents responsables des effets liés à l’expression et l’activation du récepteur 5 HT4 ne sont pas encore élucidés. Les objectifs de cette thèse ont été d’une part de développer une technique de criblage des nanocorps (fragments d’anticorps à domaine unique provenant des camélidés) contre les récepteurs 5-HT4 et 5-HT6 en utilisant notamment des approches de TR-FRET et de cytométrie de flux. Dans un second temps, l’utilisation d’une approche de protéomique combinant la purification des partenaires du récepteur 5-HT4 par affinité suivie de leur identification systématique par spectrométrie de masse a permis l’identification de partenaires protéiques potentiels associés au récepteur 5-HT4 dans les cellules HEK-293N. Parmi les protéines recrutées par le récepteur 5-HT4, nous avons notamment identifié la protéine IRS4 (Insulin Receptor Substrate 4). La protéine IRS4 est un transducteur de la voie de la signalisation de l’insuline. Étant donné qu’une dérégulation de la voie de signalisation de l’insuline est l’un des évènements majeurs impliqués dans le développement et la progression de la maladie d’Alzheimer, nous nous sommes focalisés sur ce partenaire. Après avoir validé cette interaction par Western Blot, nous avons montré une co-localisation de IRS4 avec le récepteur 5-HT4 dans les cellules HEK-293. Par ailleurs, des études fonctionnelles ont montré qu’une inhibition de l’expression de IRS4 induit une surexpression du récepteur 5-HT4 dans les cellules HEK-293, associée à une augmentation de la signalisation canonique du récepteur via la voie de la protéine Gs.Ces résultats suggèrent une modulation du trafic du récepteur 5-HT4 et donc du complexe associé incluant l’APP et l’ADAM10 par la protéine IRS4. Ce travail de thèse dévoile pour la première fois un lien fonctionnel entre la signalisation du récepteur sérotoninergique 5-HT4 et la signalisation de la voie de l’insuline via IRS4 qui pourrait être d’intérêt dans le contexte de la maladie d’Alzheimer. Il pose également les bases à une identification rapide de nanocorps dirigés contre les récepteurs 5-HT4 et 5-HT6 dont les outils immunohistologiques manquent pour approfondir la compréhension mécanistique.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03629349 , version 1 (04-04-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03629349 , version 1

Citer

Hugo Payan. Réseaux de protéines associés aux récepteurs de la sérotonine : rôle et options thérapeutiques pour la Maladie d'Alzheimer. Médecine humaine et pathologie. Université Montpellier, 2020. Français. ⟨NNT : 2020MONTT012⟩. ⟨tel-03629349⟩
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