Nanopore pour la détection de peptides vers le séquençage de protéines à l'échelle de la molécule unique. - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Nanopore-based detection of peptides towards protein sequencing at the single molecule level.

Nanopore pour la détection de peptides vers le séquençage de protéines à l'échelle de la molécule unique.

Résumé

Proteins are large molecules that play essential roles in living cells including structure, regulation and functions. They provide key information for understanding biological mechanisms and diseases. The development of new tools for rapid protein sequencing at the single molecule scale, would contribute to the diagnosis of numerous diseases and to the development of personalized medical assessment.Nanopore-based single-molecule electrical detection technology is a low-cost, real-time, and label-free analysis method, that stands out as a promising tool for the development of this application. The principle of this technique consists of using a nanometric pore (nanopore) created in a membrane separating two compartments filled with electrolyte solution. Due to the applied voltage, the electrolyte ions flow through the nanopore. The entry of individual molecules in the nanopore causes a drop in ionic current whose characteristics provide information on the chemical nature of the molecule being analyzed. Based on this principle, biomolecule sequencing can be achieved by sequentially reading the information of an unfolded protein through a nanopore.The significant advances in nanopore DNA sequencing have enhanced the potential of this technology and expanded the development of nanopore protein sequencing. This latter is, nonetheless, more challenging compared to nucleic acids because of many constraints mainly related to the nature of proteins which have a complex structure. It can be composed of 20 amino acids which may also involve chemical modifications of some of them. To our knowledge, when my thesis work has been initiated, no nanopore, whether biological unmodified, solid, or artificial, has so far made it possible to obtain sufficient amino acid resolution for reading the sequence of a protein.The foreseen scope of my thesis work is to develop a protein sequencing strategy based on the use of a biological nanopore called aerolysin, a toxin produced by the bacteria Aeromonas hydrophila which forms nanometric pores in biological membranes. Aerolysin has recently demonstrated a high resolving power, under optimal physicochemical conditions, for the analysis of different types of molecules such as neutral polymers, and oligonucleotides. Aerolysin thus represents an ideal candidate for attempting to achieve a high separation resolution permitting the detection of an amino acid.This manuscript explores the results that I obtained during my thesis work. My first major contribution is to demonstrate, for the first time, that aerolysin allows the discrimination of short peptides (from 5 to 10 amino acids) analyzed in a mixture or individually, with a separation resolution equivalent to that of an individual amino acid. My second major contribution is to demonstrate for the first time a mapping of 20 natural amino acids per nanopore, based on their electrical signatures measured through aerolysin. We have also shown that it is possible to identify chemical modifications carried by certain amino acids.
Les protéines sont des macromolécules indispensables au fonctionnement des cellules vivantes, pouvant fournir des informations clés pour comprendre les mécanismes biologiques et les maladies. Le développement de nouveaux outils pour le séquençage des protéines, rapide et à l’échelle de la molécule unique, constituerait un apport dans le diagnostic de nombreuses maladies et dans le développement de la médecine personnalisée.La technologie de détection électrique par nanopore est une méthode d'analyse à l'échelle de la molécule unique, en temps réel, sans marquage, peu coûteuse, qui se présente comme un outil prometteur pour le développement de cette application. Le principe de cette technique consiste à utiliser une membrane isolant deux compartiments remplis par une solution ionique, et percée d’un trou nanométrique, un nanopore. Sous l’action d’une différence de potentiel, un flux d’ions circule à travers le nanopore. L’entrée d’une molécule individuelle dans le nanopore entraine une chute du courant ionique dont les caractéristiques permettent d’obtenir des informations sur la nature chimique de la molécule analysée. Sur ce principe, le séquençage de biomolécules peut être réalisé par la lecture séquentielle de l’information d’une chaîne dépliée à travers un nanopore.Les avancées spectaculaires du séquençage de l’ADN par nanopore ont mis en lumière le haut potentiel de cette technologie et ont ouvert la voie vers le développement du séquençage des protéines par nanopore. Ce nouveau challenge est néanmoins bien plus difficile que pour les acides nucléiques en raison de nombreuses contraintes principalement liées à la nature des protéines qui présentent une structure complexe, qui peuvent être composées de 20 acides aminés, et qui présentent des modifications chimiques de certains de leurs acides aminés. A notre connaissance, au commencement de mes travaux de thèse, aucun nanopore, qu’il soit biologique non modifié, solide, ou artificiel, n’avait permis d’obtenir une résolution d’un acide aminé suffisante à la lecture de la séquence d’une protéine.L’ambition de mon projet de thèse est de développer une stratégie de séquençage des protéines basée sur l’utilisation d’un nanopore biologique, l’aérolysine, une toxine produite par la bactérie Aeromonas hydrophila, capable de former des pores nanométriques dans les membranes biologiques. L’aérolysine, a récemment démontré un haut pouvoir de résolution, dans des conditions physico-chimiques optimales, pour l’analyse de différents types de molécules, comme des polymères neutres et des oligonucléotides. L’aérolysine se présente ainsi comme un candidat de choix pour tenter d’atteindre une résolution de détection d’un acide aminé.Ce manuscrit a pour objectif de présenter les résultats que j’ai obtenus durant ma thèse. La première contribution majeure de mes travaux est de montrer, pour la première fois, que l’aérolysine permet d’obtenir la discrimination de courts peptides (de 5 à 10 acides aminés), analysés dans un mélange ou individuellement, avec une résolution de séparation d’un acide aminé individuel. La deuxième contribution majeure de mes travaux est l’établissement de la première cartographie des 20 acides aminés naturels par nanopore, sur la base de leurs signatures électriques mesurées à travers l’aérolysine. Nous avons également montré qu’il est possible d’identifier des modifications chimiques portées par certains acides aminés.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03635875 , version 1 (08-04-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03635875 , version 1

Citer

Hadjer Ouldali. Nanopore pour la détection de peptides vers le séquençage de protéines à l'échelle de la molécule unique.. Biologie moléculaire. CY Cergy Paris Université, 2021. Français. ⟨NNT : 2021CYUN1024⟩. ⟨tel-03635875⟩
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