Etude des compartiments cellulaires impliqués dans la signalisation calcique au sein des astrocytes - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Study of cellular compartments involved in calcium signaling in astrocytes

Etude des compartiments cellulaires impliqués dans la signalisation calcique au sein des astrocytes

Lucas Benoit
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1223855
  • IdRef : 267473621

Résumé

Astrocytes are essential cells that are involved in the maintenance of the central nervous system (CNS) homeostasis. These cells are not electrically excitable, but the evolution of optical microscopy techniques and the development of high temporal resolution calcium probes have made it possible to demonstrate that there is a 'language' within astrocytes that relies on variations in the intracellular concentration of calcium ions. It is now known that 80-90% of this Ca++ signaling takes place in microdomains located in the thinnest cytoplasmic extensions of the astrocyte and that part of this signaling is correlated with neuronal activity. The origin of these calcium signals is still poorly understood, and at present there are no obvious structural features. Biphoton microscopy studies have shown that inositol triphosphate receptors (IP3Rs), generally located on the endoplasmic reticulum, play an important role in this signaling, but to date the link between the endoplasmic reticulum and calcium signals has not been formally established. The main difficulty is that these microdomains are smaller than the resolution of light microscopes, so electron microscopy studies are needed to resolve the fine ultrastructure of these structures; moreover, the morphology of the fine extensions of the astrocyte requires three-dimensional approaches to understand their interaction with synaptic elements. In this thesis, we took advantage of new cryo-methods to set up an electron microscopy sample preparation protocol that optimally preserves the astrocyte ultrastructure. For this, we compared different sample fixation methods: adult mouse hippocampi were sectioned with a vibratome and the sections were either fixed with aldehydes or vitrified by high pressure freezing, or fixed by a combination of these two methods. The preservation of the tissue structure was then assessed and we have shown that the hybrid approach is the most effective in preserving astrocytes. It is therefore possible to fix the tissue slightly with aldehydes before freezing the samples without altering the ultrastructure. The protocol is thus compatible with perfusion fixation and can also be used with near-infrared branding strategies to study astrocytes by using a correlative light and electron microscopy approach. Using the established sample preparation strategy, we then used a focused ion beam scanning electron microscope (FIB/SEM) to image, in 3D, astrocyte fragments with a 4 nm isotropic voxel. We then implemented an image analysis methodology to perform semi-automatic segmentation of astrocyte fragments and intracellular compartments such as mitochondria, endoplasmic reticulum and numerous synapses. This approach allowed us to obtain quantitative 3D morphological measurements and we demonstrated the presence of endoplasmic reticulum saccule in the thinnest domains of the astrocytes, domains which are also devoid of mitochondria but which are the sites of contact with synapses. We also showed, by 3D immunostaining, that these compartments of the endoplasmic reticulum contain inositol 3-phosphate receptors, whose role in calcium signaling is well known. Finally, I brought my image analysis skills to segment a Hela cell that has been imaged with the new cryo-FIB/SEM technique, a technique that allows 3D imaging of vitrified samples without the need of any staining with heavy metals. I have shown that it is possible to use this technique not only to study cell ultrastructure but also to localize intracellular proteins. This approach thus opens up perspectives for the study of the astrocyte and its ultrastructural organization in its native state.
Les astrocytes sont des cellules essentielles au maintien de l’homéostasie du système nerveux central (SNC). Ce ne sont pas des cellules électriquement excitables, mais l’évolution des techniques de microscopie optique et le développement de sondes calciques à haute résolution temporelle ont permis de mettre en évidence qu’il existe un « langage » au sein des astrocytes qui repose sur des variations de la concentration intracellulaire en ions calciums. On sait désormais que 80-90 % de cette signalisation prend place dans des microdomaines qui sont localisés au niveau des prolongements cytoplasmiques les plus fins de l’astrocyte et qu’une partie de cette signalisation est corrélée à l’activité neuronale. L’origine de ces signaux calciques est encore mal connue, à l’heure actuelle il n’y a d’ailleurs pas de caractéristique structurale évidente. Les études en microscopie bi photoniques ont montré que les récepteurs à l'inositol triphosphate (IP3Rs) généralement situés sur le réticulum endoplasmique jouent un rôle important dans cette signalisation, mais à ce jour, le lien entre le réticulum endoplasmique et les signaux calciques n’a pas été formellement établi. La difficulté principale résulte du fait que ces microdomaines sont d’une taille inférieure à la résolution des microscopes optiques, les études de microscopie électronique sont donc nécessaires pour résoudre l’ultrastructure fine de ces structures ; de plus, la morphologie des fins prolongements de l’astrocyte requiert des approches tridimensionnelles pour appréhender leur interaction avec les éléments synaptiques. Dans ce travail de thèse, nous avons tiré profit de nouvelles cryo-méthodes pour élaborer un protocole de préparation des échantillons pour la microscopie électronique qui préserve autant que possible l’ultrastructure des astrocytes ; nous avons pour cela comparé différentes méthodes de fixation d’échantillons. Ainsi, l’hippocampe de souris adultes a été sectionné et fixé par méthode cryogénique ou conventionnelle. La préservation de la structure du tissu a ensuite été évaluée et nous avons ainsi montré que l’approche hybride est la mieux à même de préserver ces cellules. Ainsi, le protocole est compatible avec une fixation par perfusion et peut aussi être utilisé avec les stratégies de marquage par infrarouge proche permettant d’étudier les astrocytes par une approche corrélative en microscopie photonique et électronique. En utilisant cette stratégie, nous avons ensuite utilisé un microscope à balayage à faisceau d’ions focalisés (FIB/SEM) pour imager, en 3D, des fragments d’astrocytes avec un voxel isotropique de 4 nm. Nous avons ensuite mis en place une méthodologie en analyse d’image pour réaliser une segmentation semi-automatique des fragments d’astrocytes et des compartiments intracellulaires ainsi que de nombreuses synapses. Cette approche nous a permis d’obtenir des mesures quantitatives morphologiques en 3D : nous avons ainsi démontré la présence de saccule de réticulum endoplasmique dans les domaines les plus fins de l’astrocytes. Ces domaines qui sont d’ailleurs dépourvus de mitochondries, mais qui sont les sites de contact avec les synapses. Nous avons également montré, par un immunomarquage en 3D, que ces compartiments du réticulum contiennent des récepteurs à l’inositol 3-phosphate, dont le rôle dans la signalisation calcique est connu. Enfin, j’ai apporté mes compétences en analyse d’image pour segmenter une cellule Hela qui a été imagée avec la nouvelle technique de cryo-FIB/SEM, une technique qui permet d’imager en 3 D des échantillons vitrifiés sans qu’il ne soit nécessaire de les colorer avec des métaux lourds. J’ai ainsi montré qu’il était possible d’utiliser cette technique non seulement pour étudier l’ultrastructure cellulaire, mais aussi pour localiser des protéines intracellulaires. Cette approche ouvre donc des perspectives pour l’étude de l’astrocyte et de son organisation ultrastructurale à l’état natif.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03974619 , version 1 (06-02-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03974619 , version 1

Citer

Lucas Benoit. Etude des compartiments cellulaires impliqués dans la signalisation calcique au sein des astrocytes. Neurosciences. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2022. Français. ⟨NNT : 2022GRALV060⟩. ⟨tel-03974619⟩
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