Engineering and applications of glycosyltransferases for synthetic glycobiology : Two galactosyltransferases, MGD1 and LgtC, as case studies - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Engineering and applications of glycosyltransferases for synthetic glycobiology : Two galactosyltransferases, MGD1 and LgtC, as case studies

Ingénierie et applications des glycosyltransférases pour la glycobiologie synthétique : Deux galactosyltransférases, MGD1 et LgtC, comme études de cas

Résumé

Glycosyltransferases (GTs) are enzymes able to glycosylate a wide range of molecules. For this reason, GTs are extensively used in therapeutic drug development. In this PhD project, we explored the application of GTs as tools for synthetic glycobiology, with a focus on the glycosylation of synthetic membranes. This project is split into two main parts. The first part studies the donor specificity and catalytic mechanism of a model GT which works on a lipid membrane, MGD1 from Arabidopsis thaliana. MGD1 is a galactosyltransferase that transfers a galactose from UDP-Gal to diacylglycerol (DAG), and needs anionic lipids such as phosphatidylglycerol (PG) or phosphatidic acid (PA) for activity. We used a structure and sequence-guided approach to engineer a MGD1 mutant altering its donor specificity to UDP-Glc. We performed mutational studies with the aim to consolidate the previously proposed PG-His catalytic dyad and probe the binding site for the allosteric activator PA. The second part explored the application of LgtC, a bacterial galactosyltransferase, to synthesize the Gb3 antigen on synthetic membrane systems. The capability of LgtC to generate Gb3 on giant unilamellar vesicles (GUVs) was demonstrated by confocal microscopy using fluorescently-labelled Shiga toxin B subunit (StxB), a lectin specific for Gb3. Quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D) allowed quantitative evaluation of Gb3 formed on supported lipid bilayer (SLB). The potential of LgtC and MGD1 to transfer a functionalised galactose (Gal-N3) to their respective acceptors was also evaluated. The knowledge gained from this research has value in the engineering of GTs as tools in synthetic glycobiology applications.
Les glycosyltransférases (GT) sont des enzymes capables de glycosyler un large éventail de molécules. Pour cette raison, elles sont largement utilisées dans le développement de molécules thérapeutiques. Dans ce projet de thèse, nous avons exploré le potentiel des GTs comme outils pour la glycobiologie synthétique, en nous concentrant sur leur capacité à glycosyler des membranes synthétiques. Ce projet est divisé en deux parties. La première partie porte sur l’étude de la spécificité vis-à-vis du nucléotide sucre donneur et du mécanisme catalytique d'une GT modèle qui fonctionne sur une membrane lipidique, la MGD1 d'Arabidopsis thaliana. MGD1 est une galactosyltransférase qui transfère un galactose de l'UDP-Gal au diacylglycérol (DAG), et qui a besoin de lipides anioniques tels que le phosphatidylglycérol (PG) ou l'acide phosphatidique (PA) pour son activité. Nous avons utilisé une approche basée sur l’analyse de séquences et de structures de GT pour obtenir un mutant MGD1 pouvant utiliser l’UDP-glucose. Par des études de mutagenèse dirigée, nous avons cherché à consolider l’hypothèse d’une dyade catalytique PG-His chez MGD1 et à identifier le ou les sites de liaison de l’enzyme au PA. Dans la deuxième partie du projet, nous avons testé la capacité de la LgtC, une galactosyltransférase bactérienne, à synthétiser l'antigène Gb3 sur des systèmes membranaires synthétiques. La capacité de la LgtC à générer du Gb3 sur des vésicules unilamellaires géantes (GUVs) a été démontrée par microscopie confocale en utilisant une lectine spécifique du Gb3, la sous-unité B de la Shiga-toxine (StxB) marquée par fluorescence. L’utilisation de la microbalance à cristal de quartz avec mesure de dissipation (QCM-D) a permis une évaluation quantitative du Gb3 formé sur une bicouche lipidique supportée (SLB). Le potentiel de LgtC et MGD1 à transférer un galactose fonctionnalisé (Gal-N3) à leurs accepteurs respectifs a également été évalué. Les connaissances acquises dans le cadre de cette recherche ont des retombées pour des applications potentielles des GTs en glycobiologie synthétique.
Fichier principal
Vignette du fichier
JABEGUERO_2022_archivage.pdf (9.13 Mo) Télécharger le fichier
Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04055306 , version 1 (02-04-2023)

Identifiants

  • HAL Id : tel-04055306 , version 1

Citer

Dylan Caccam Jabeguero. Engineering and applications of glycosyltransferases for synthetic glycobiology : Two galactosyltransferases, MGD1 and LgtC, as case studies. Biochemistry [q-bio.BM]. Université Grenoble Alpes [2020-..], 2022. English. ⟨NNT : 2022GRALV042⟩. ⟨tel-04055306⟩
100 Consultations
28 Téléchargements

Partager

Gmail Facebook X LinkedIn More