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              <p>Tubulin post-translational modifications (PTMs) diversify the microtubule lattice thus potentially contributing to the functional versatility of the microtubule network by finely regulating its properties. In neurons one of the major PTMs is polyglutamylation, which is the reversible, enzymatically catalyzed addition and removal of single glutamate units in the form of a side peptide chain on the disordered alpha- and beta-tubulin C-terminal tails. From a biochemical perspective, the accumulation of the negatively charged glutamates protruding from the microtubule surface could impact the activity of microtubule-associated proteins (MAPs), many of which rely on positively charged domains to bind the microtubule.In the scope of this thesis I investigated the role of tubulin PTMs and in particular polyglutamylation, in the activity modulation of diverse categories of microtubule interactors using in vitro TIRF microscopy reconstitution assays. By applying multiple purification approaches, I could isolate tubulin with various degrees of modifications, including mouse brain tubulin that is rich in most PTMs and HeLa cell tubulin that is largely modification-free. Moreover, by using mouse knockout models for the two major polyglutamylating enzymes in the central nervous system, TTLL1 and TTLL7, I could purify brain tubulin that specifically lacks polyglutamylation on the alpha- or beta-subunit, respectively. In vitro assays with these various microtubule species show that polyglutamylation is required for the high-affinity binding of the neuron-specific structural MAPs Tau and MAP2, but it weakens the association of the mitotic EML3. By distinguishing alpha- and beta-tubulin glutamylation it is possible to differentiate between the effects arising from changes in the electrostatic charge strength on the microtubule surface, and those contributed to specific recognition by the assayed proteins of one of the modification sites. The in vitro reconstitution approach is further applied to study the behavior of other microtubule interactors in the presence or absence of tubulin PTMs, whereby it was demonstrated that the severing enzyme Katanin and the motor protein Kif5B are also sensitive to polyglutamylation.Apart from this, my thesis includes data of a successfully applied CRISPR/Cas9 strategy for endogenous protein tag knock-in in cultured primary hippocampal neurons, derived from the TTLL1 and TTLL7 knockout mice with reduced tubulin polyglutamylation. Using this system I studied the dynamics and distribution of the Alzheimer’s disease-related MAP Tau with fluorescence live-cell imaging and ultrastructure expansion microscopy. Additionally, I demonstrate how a combination of two super-resolution microscopy techniques– expansion microscopy and STED, could help unravel a long-standing challenge in the field of neuronal cell biology: the spatial resolution of single microtubules parallelly arranged in bundles within the axon and dendrites. This breakthrough in light microscopy resolution allows the in-depth study of the microtubule architecture upon loss of polyglutamylation and more generally the mapping of the PTMs distribution on the neuronal microtubules using immunofluorescence.Altogether, the findings of this thesis present direct in vitro evidence in support of the “tubulin code” hypothesis, which predicts that tubulin PTMs can act as fine-tuning regulators of microtubule-interacting proteins. Moreover, it opens a new direction for the study of how tubulin polyglutamylation as a highly abundant neuronal PTM could impact the architecture of the neuronal cytoskeleton.</p>
            </abstract>
            <abstract xml:lang="fr">
              <p>Les modifications post-traductionnelles (PTMs) de la tubuline diversifient le réseau de microtubules, contribuant ainsi potentiellement à la polyvalence fonctionnelle en régulant finement ses propriétés. Dans les neurones, l'une des principales PTMs est la polyglutamylation, c'est-à-dire l'ajout et le retrait réversibles d'unités de glutamate sous la forme d'une chaîne peptidique latérale sur les queues C-terminales de l'alpha- et de la bêta-tubuline. D'un point de vue biochimique, l'accumulation de glutamates chargés négativement dépassant de la surface des microtubules pourrait avoir un impact sur l'activité des protéines associées aux microtubules (MAPs), dont beaucoup dépendent de domaines chargés positivement pour se lier aux microtubules.Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle des PTMs de la tubuline, et en particulier de la polyglutamylation, dans la modulation de l'activité de diverses catégories d'interacteurs de microtubules en utilisant des essais de reconstitution in vitro par microscopie TIRF. En appliquant de multiples approches de purification, j'ai pu isoler la tubuline avec différents degrés de modifications, y compris la tubuline du cerveau de souris qui est riche dans la plupart des PTMs et la tubuline des cellules HeLa qui est largement exempte de modifications. De plus, en utilisant des modèles de souris knock-out pour les deux principales enzymes de polyglutamylation, TTLL1 et TTLL7, j'ai pu purifier de la tubuline cérébrale spécifiquement dépourvue de polyglutamylation sur la sous-unité alpha ou bêta, respectivement. Des essais in vitro avec ces différentes espèces de microtubules montrent que la polyglutamylation est nécessaire pour la liaison à haute affinité des MAPs neuronales, Tau et MAP2, mais qu'elle affaiblit l'association de l'EML3 mitotique. En distinguant la glutamylation de l'alpha- et de la bêta-tubuline, il est possible de différencier les effets découlant des changements de la force de charge électrostatique à la surface des microtubules, et ceux contribuant à la reconnaissance spécifique par les protéines testées de l'un des sites de modification. L'approche de reconstitution in vitro est ensuite appliquée pour étudier le comportement d'autres interacteurs des microtubules en présence ou en l'absence de PTMs de la tubuline, ce qui a permis de démontrer que l'enzyme de coupure Katanin et la protéine motrice Kif5B sont également sensibles à la polyglutamylation.En outre, ma thèse comprend des données relatives à une stratégie CRISPR/Cas9 appliquée pour l'introduction d'étiquettes de protéines endogènes dans des neurones hippocampiques primaires cultivés, dérivés de souris knock-out TTLL1 et TTLL7. Grâce à ce système, j'ai étudié la dynamique et la distribution de la MAP Tau, liée à la maladie d'Alzheimer, à l'aide de l'imagerie des cellules vivantes et de la microscopie d'expansion de l'ultrastructure. En outre, je démontre comment la combinaison de deux techniques de microscopie à super-résolution - la microscopie d'expansion et la STED - pourrait aider à résoudre un problème de longue date dans le domaine de la biologie des cellules neuronales : la résolution spatiale des microtubules uniques disposés parallèlement en faisceaux dans l'axone et les dendrites. Cette avancée dans la résolution de la microscopie optique permet l'étude approfondie de l'architecture des microtubules après la perte de la polyglutamylation et, plus généralement, la cartographie de la distribution des PTM sur les microtubules neuronaux.Les résultats de cette thèse présentent des preuves directes in vitro à l'appui de l'hypothèse du "code de la tubuline", qui prédit que les PTMs de la tubuline peuvent agir comme des régulateurs de réglage fin des protéines interagissant avec les microtubules. En outre, elle ouvre une nouvelle voie pour l'étude de la façon dont la polyglutamylation de la tubuline, une PTM neuronale très abondante, pourrait avoir un impact sur l'architecture du cytosquelette neuronal.</p>
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