Stimulation by a turbulent flow in bioreactors for the production of extracellular vesicles - TEL - Thèses en ligne Access content directly
Theses Year : 2022

Stimulation by a turbulent flow in bioreactors for the production of extracellular vesicles

Stimulation par un flux turbulent en bioréacteurs pour la production de vésicules extracellulaires

Alice Grangier
  • Function : Author
  • PersonId : 1210753
  • IdRef : 273995588

Abstract

Large scale manufacturing of extracellular vesicles (EVs) is a major stake for the successful translation of EV-based therapies into clinics. In this context, our laboratory developed a high-yield and scalable production method for EVs compatible with Good Manufacturing Practice (GMP) by inducing a turbulent flow in bioreactors to stimulate cells attached to microcarriers. One of the aims of my thesis was to study the effect of turbulence in bioreactors on producer cells and their "secretome", which includes EVs. To this end, we used cutting-edge characterization techniques for EVs such as fluorescent Nanoparticle Tracking Analysis (NTA), Nanoparticle flow cytometry (NanoFCM), Exoview platform, proteomics analysis and asymmetric flow field-flow fractionation (A4F). First, we showed that turbulence was well tolerated by adherent cells and semi-quantitatively assessed biomarkers of turbulence EVs. Another major objective was then to extend the framework of turbulence high-yield EV production to cells in suspension. We showed that upon turbulence stimulation, three different cells line yielded massive amounts of particles compared to starvation. Moreover, we evidenced that a trade-off between viability and particle yield could be achieved by also modulating turbulence stimulation duration. This was achieved first in 100 mL vessels then up scaled to 1 L vessels. Next, we investigated the effect of cell viability on the identity and potency of THP-1 derived turbulence secretome, revealing a modulation of physical and biological characteristics. Then, the analysis of THP-1 secretome by A4F enabled us to shed light on a turbulence specific subpopulation of small particles. Further investigation will be required to evaluate the nature and potency of this subpopulation. Finally, we propose a retrospective analysis of the data acquired during this study which also confirmed a specific phenotypic and functional identity of THP-1 derived turbulence EV-enriched secretome.
La production à grande échelle de vésicules extracellulaires (VEs) est un enjeu majeur pour assurer la translation clinique des thérapies à bases de VEs. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé une technique de production à haut rendement, adaptable à grande échelle selon les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF), consistant à induire un flux turbulent en bioréacteurs pour stimuler des cellules sur des micro-porteurs. Un des buts de ma thèse a été d'étudier l'effet de la turbulence en bioréacteurs sur les cellules productrices et sur leur "sécrétome", incluant des VEs. Afin de remplir cet objectif, nous avons utilisé des techniques de pointe de caractérisation de VEs, comme l'analyse par suivi du mouvement des nanoparticules (NTA, « Nanoparticle Tracking Analysis ») équipée pour la détection de fluorescence, la cytométrie de flux dédiée aux nanoparticules (NanoFCM), la plateforme Exoview, des analyses protéomiques et le fractionnement par couplage flux-force à l'aide d'un flux croisé (A4F). Tout d'abord, nous avons montré que la turbulence était bien tolérée par des cellules adhérentes, puis évalué de façon semi-quantitative les biomarqueurs des VEs produites par turbulence. Un autre des objectifs majeurs a ensuite été d'étendre le cadre de la production à haut rendement de VEs par turbulence à des cellules en suspension. Nous avons montré que suite à une stimulation par turbulence, trois différentes lignées cellulaires permettaient d'obtenir des quantités massives de particules comparées à la carence en sérum. De plus, nous avons mis en évidence qu'un compromis entre la viabilité et le rendement de particules pouvait être atteint en modifiant également le temps d'exposition à la turbulence. Ces résultats ont d'abord été obtenus dans des récipients de 100 mL puis à plus grande échelle en récipients de 1 L. Ensuite, nous avons étudié l'effet de la viabilité cellulaire sur l'identité et la fonctionnalité du sécrétome issu de cellules THP-1, révélant une modulation des caractéristiques physiques et biologiques due à la turbulence. Par la suite, l'analyse du sécrétome des THP-1 par l'A4F nous a permis d'observer une sous-population, composée de petites particules et spécifique à la turbulence, dont la nature et la fonctionnalité devront être caractérisées dans des études ultérieures. Finalement, nous avons ensuite proposé une analyse rétrospective des données acquises au cours de ces travaux qui a également confirmé une identité biologique et fonctionnelle du sécrétome enrichi en VEs dérivé de THP-1.
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Dates and versions

tel-04643109 , version 1 (10-07-2024)

Identifiers

  • HAL Id : tel-04643109 , version 1

Cite

Alice Grangier. Stimulation by a turbulent flow in bioreactors for the production of extracellular vesicles. Physics [physics]. Université Paris Cité, 2022. English. ⟨NNT : 2022UNIP7174⟩. ⟨tel-04643109⟩
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