Analyse des interactions ADN lésé / protéines : Optimisations méthodologiques et applications aux dommages de l'ADN engendrés par les dérivés du platine - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2010

Analysis of damaged DNA / proteins interactions: Methodological optimizations and applications to DNA lesions induced by platinum anticancer drugs

Analyse des interactions ADN lésé / protéines : Optimisations méthodologiques et applications aux dommages de l'ADN engendrés par les dérivés du platine

Résumé

DNA lesions contribute to the alteration of DNA structure, thereby inhibiting essential cellular processes. Such alterations may be beneficial for chemotherapies, for example in the case of platinum anticancer agents. They generate bulky adducts that, if not repaired, ultimately cause apoptosis. A better understanding of the biological response to such molecules can be obtained through the study of proteins that directly interact with the damages. These proteins constitute the DNA lesions interactome. This thesis presents the development of tools aiming at increasing the list of platinum adduct-associated proteins. Firstly, we designed a ligand fishing system made of damaged plasmids immobilized onto magnetic beads. Three platinum drugs were selected for our study: cisplatin, oxaliplatin and satraplatin. Following exposure of the trap to nuclear extracts from HeLa cancer cells and identification of retained proteins by proteomics, we obtained already known candidates (HMGB1, hUBF, FACT complex) but also 29 new members of the platinated-DNA interactome. Among them, we noted the presence of PNUTS, TOX4 and WDR82, which associate to form the recently-discovered PTW/PP complex. Their capture was then confirmed with a second model, namely breast cancer cell line MDA MB 231, and the biological consequences of such an interaction now need to be elucidated. Secondly, we adapted a SPRi biochip to the study of platinum-damaged DNA/proteins interactions. Affinity of HMGB1 and newly characterized TOX4 for adducts generated by our three platinum drugs could be validated thanks to the biochip. Finally, we used our tools, as well as analytical chemistry and biochemistry methods, to evaluate the role of DDB2 (a factor involved in the recognition of UV-induced lesions) in the repair of cisplatin adducts. Our experiments using MDA MB 231 cells differentially expressing DDB2 showed that this protein is not responsible for the repair of platinum damages. Instead, it appears to act as a positive mediator of their cytotoxicity. In the near future, the abovementioned microsystems will be adapted to the study of the interactome of other DNA lesions.
La présence de lésions sur l'ADN contribue à déstabiliser sa structure, bloquant certains processus vitaux pour la cellule. Ces altérations peuvent cependant avoir un intérêt thérapeutique, par exemple dans le cas de l'utilisation d'anticancéreux tels que les dérivés du platine. Les adduits volumineux qu'ils génèrent, s'ils ne sont pas réparés, entraînent la cellule vers l'apoptose. La compréhension de la réponse à ces anticancéreux passe par l'étude des protéines qui interagissent directement avec les dommages, et dont l'ensemble constitue l'interactome des lésions de l'ADN. Ce travail de thèse présente le développement d'outils destinés à compléter la liste des protéines associées aux adduits du platine. Dans un premier temps, nous avons utilisé un piège à protéines (ligand fishing) constitué de plasmides lésés fixés sur des billes magnétiques. Trois dérivés du platine ont été sélectionnés pour générer les lésions : le cisplatine (molécule princeps), l'oxaliplatine, et le satraplatine. Ce piège a permis d'obtenir, à partir d'extraits nucléaires issus de cellules cancéreuses HeLa et grâce à une identification par protéomique, une liste de candidats comprenant des protéines déjà connues (HMGB1, hUBF, complexe FACT), mais aussi 29 nouveaux membres de l'interactome. Parmi ceux-ci, nous avons relevé PNUTS, TOX4 et WDR82, qui constituent les sous-unités du complexe PTW/PP, très récemment découvert. La présence de ce complexe a été également validée sur un modèle d'adénocarcinome mammaire MDA MB 231, et les conséquences biologiques de son interaction avec les adduits du platine devront maintenant être précisées. Dans un second temps, nous avons mis au point une biopuce permettant d'étudier les interactions ADN lésé/protéine par SPRi. Les affinités respectives d'HMGB1 et du nouveau candidat TOX4 pour les adduits des trois dérivés du platine ont pu être ainsi confirmées. Dans un dernier temps, nous avons étudié le rôle de DDB2 (acteur de la reconnaissance des photoproduits UV) dans la prise en charge des adduits platinés. Les expérimentations menées sur les cellules MDA MB 231 exprimant DDB2 de façon différentielle nous ont permis de vérifier que cette protéine ne participe pas à la réparation des adduits du cisplatine, contribuant plutôt à potentialiser l'action cytotoxique de cet agent. Dans le futur, nos microsystèmes pourront être adaptés à l'étude de l'interactome d'autres lésions de l'ADN.
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Dates et versions

tel-00549987 , version 1 (23-12-2010)

Identifiants

  • HAL Id : tel-00549987 , version 1

Citer

Christophe Bounaix Morand Du Puch. Analyse des interactions ADN lésé / protéines : Optimisations méthodologiques et applications aux dommages de l'ADN engendrés par les dérivés du platine. Sciences du Vivant [q-bio]. Université Joseph-Fourier - Grenoble I, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00549987⟩
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