Implication des factures de remodelage de chromatine de la famille CHD dans les réseaux de régulation transcriptionnelle des cellules souches embryonnaires
Résumé
Embryonic stem cells have the unique capacity to divide indefinitely and to differentiate in all cell types. They are promising for therapeutic applications for future treatments. Understanding the contribution of chromatin remodeler to the control of gene expression is critical to reach this goal. The Chd family which belongs to the SNF2 superfamily, contains nine members and represend about one third of the chromatin remodelers expressed in ES cells. Our aim was to identify the target genes of each remodeler, to understand how they are involved in transcription regulation and how they share chromatin regulation in ES. This large-scale study started with the tagging of each Chd. Using homologous recombination, we generated 9 ES cell lines each carring a tagged allele. The C-terminus of each gene was fused with a FLAG-HA tag. This tag allowed efficient chromatin immunoprecipitation for all the proteins. We performed tandem affinity chromatin IP for each protein. Immunoprecipitated DNA was sequenced onto an Illumina plateform in the lab of I. Gut (CEA/CNG and CNAG). We next analysed the transcriptome of Chd-depleted ES cells, using microarray hybridization and RNA-seq strategy. Our data show that NuRD (Chd4, Hdac2) is extensively involved in ES transcriptional pluripotency core network. Data obtained for Chd1, Chd8 and Chd4 show that each Chd has a particular binding pattern onto the mouse ES cell genome, suggesting different roles. However they regulated each other and belong to the same complexe core circuit. Finally, our results lead to new hypothesis to explain how Chd proteins contribute to genome regulation.
Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) ont la capacité unique de se diviser indéfiniment et de pouvoir se différencier en de multiples types cellulaires. Elles apparaissent donc très prometteuses comme agents thérapeutiques dans les traitements médicaux du futur. Un enjeu majeur de la recherche actuelle consiste à comprendre la contribution des protéines régulatrices de la chromatine à la plasticité et au contrôle de l'expression du génome des cellules. La famille des remodeleurs Chd, qui fait partie de la super famille SNF2, comprend neuf membres, soit le tiers des remodeleurs exprimés dans les cellules ES murines. L'objectif principal de ce projet de thèse a consisté à identifier de manière exhaustive les gènes cibles de chaque facteur pour comprendre comment ils participent à la régulation du génome et se partagent le remodelage de la chromatine. Nous avons entrepris un projet à grande échelle dans lequel chaque gène codant chaque Chd a été fusionné, à son extrémité carboxy-terminale, à une séquence codant une étiquette, par recombinaison homologue en cellules ES. Les cellules ES étiquetées ont ensuite été utilisées pour des expériences d'immunoprécipitation de chromatine (ChIP-seq). La présence de l'étiquette a permis de standardiser et d'optimiser les méthodes d'immunoprécipitation des protéines. Les fragments d'ADN isolés ont ensuite été séquencés dans le laboratoire d'Ivo Gut (CEA/CNG -Evry- et CNAG -Barcelone-). Nous avons également analysé les transcriptomes des cellules ES où la déplétion de chaque protéine Chd a été réalisée, par hybridation sur puce et RNA-seq. Ces données ont permis de montrer le rôle de NuRD (Chd4, Hdac2) au sein des réseaux de la régulation transcriptionnelle des ES. Les données obtenues pour les facteurs Chd1, Chd8 et Chd4 montrent des rôles différents mais interconnectés pour chaque protéine. Enfin, ces données nous ont permis de proposer des hypothèses pour expliquer comment ces protéines contribuent à la régulation du génome.