New extraction, fractionation and identification methodologies : application to sea buckthorn bioactive molecules
Nouvelles méthodologies d'extraction, de fractionnement et d'identification : application aux molécules bioactives de l'argousier (Hippophae rhamnoides)
Résumé
Plant materials constitute an important source of natural bioactive molecules. Characterisation of these molecules requires often multiple, long and expensive development steps. The aim of this PhD thesis consists of innovation and development of new methods of extraction, fractionation and identification of natural metabolites from plants. We used sea buckthorn as plant model (Hippophaë rhamnoides, Elaeagnaceae) an Eurasian thorny shrub known to possess various phytochemical properties and pharmaceutical effects. In the first part of this work a ―green‖ solvent-free microwave assisted extraction, based on the combined use of pressure, temperature and microwave irradiation has been developed. This approach allows fast and efficient extraction of phenolic compounds while maintaining an important antioxidant capacity. In the second part of this work, a new multidimensional approach coupling CPC and HPLC-UV-MS was developed. This technique allows the separation at semi-preparative scale and the online identification of isolated molecules. Using this approach, 3 phenolic acids and 20 flavonols from the solvent free sea buckthorn berries extract were identified by HPLC-MS/MS. Antioxidant activity and cytotoxicity of fractions were studied in vitro and in cellulo. In the last part of this work, the antioxidant and antimicrobial potentials of different sea buckthorn organs, which were correlated to the presence of flavonoids and proanthocyanidins has been demonstrated. The CPC-HPLC-UV-MS technique was also applied to the fractionation and the partial identification of compounds extracted from sea buckthorn root.
La richesse moléculaire des végétaux constitue une source importante de molécules bioactives d‘origine naturelle. La mise en évidence de ces molécules nécessite de nombreuses étapes souvent longues et couteuses. L‘objectif de cette thèse a donc consisté en l‘innovation et le développement de nouvelles méthodologies d‘extraction, de fractionnement et d‘identification de produits naturels d‘origine végétale. Pour cela nous avons utilisé comme modèle végétal l‘argousier (Hippophaë rhamnoides, Elaeagnaceae) qui est un arbuste épineux du plateau Eurasiatique connu pour sa richesse phytochimique et son potentiel thérapeutique. Ce travail a d‘abord conduit au développement d‘une méthode d‘extraction « verte » sans solvant assistée par micro-ondes, basée sur l‘utilisation combinée de la pression, de la température et des micro-ondes. Il a pu être démontré que cette méthodologie permet d‘extraire rapidement et efficacement des composés phénoliques tout en conservant un potentiel antioxydant important. Dans une seconde partie, une nouvelle approche multidimensionnelle couplant la CPC et l‘HPLC-UV-MS a été développée. Cette technique permet la séparation à l‘échelle semi-préparative et l‘identification en ligne des molécules séparées. Il a ainsi pu être identifié par HPLC-MS/MS 3 acides phénoliques et 20 dérivés de flavonols dans l‘extrait micro-ondes sans solvant de baies d‘argousier. L‘activité antioxydante et la cytotoxicité des fractions a également été étudiée in vitro et in cellulo. Enfin la dernière partie de ce travail a démontré le potentiel antioxydant et antimicrobien de différents organes de l‘argousier, qui a été corrélé à la présence flavonoïdes et de proanthocyanidine. L‘intérêt du couplage CPC-HPLC-UV-MS a également été illustré par le fractionnement de deux molécules d‘un extrait actif de racines d‘argousier.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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