The regulation of plastidial proteins by calmodulins
La régulation des protéines plastidiales par la calmoduline
Résumé
Calmodulin (CaM) is an important modulator of cell responses of eukaryotes. This protein is composed of four calcium (Ca2+)-binding sites and a flexible central helix. CaM can interact with other proteins in a Ca2+-dependent way. This leads to a wide variety of effects, such as activation/inhibition of enzymes, opening of membrane channels and regulation of protein trafficking. The identification of high-affinity CaM targets requires techniques allowing the study of the CaM-binding parameters of a large number of protein, and in several conditions mimicking the cell environment (e.g. presence of ligands or other proteins). The first objective of this PhD was to develop flexible and quantitative assays of CaM-partners interactions based on measurements of fluorescence anisotropy. these tests were used to perform a quantitative characterization of the interaction between CaM and two previously identified targets located in Arabidopsis chloroplast (NADK2 and Tic32). We then performed a high-throughput analysis (CaM-affinity chromatography coupled with mass spectrometry) in order to detect new potential plastidial CaM targets. We validated our approach with several biochemical techniques. We finally focused our attention on the ceQORH protein, whose high CaM affinity was confirmed by several tests. Our results confirm the Ca2+-dependent CaM affinity of NADK2, Tic32 and ceQORH and provide new elements for understanding the effects of these interactions. In addition, in order to verify the presence of CaMs or CaM-like proteins in the chloroplast, we used a biochemical and proteomic approach. We also studied the intracellular localization of some putative plastidial CMLs tagged with GFP in Arabidopsis protoplasts. For the moment, these approaches did not allow identifying such proteins in the chloroplast.
La calmoduline (CaM) est une protéine modulatrice de la réponse cellulaire chez les eucaryotes composée de quatre domaines de liaison au calcium et d'une hélice centrale flexible. Elle peut interagir avec d'autres protéines en présence de calcium, entraînant l'activation et l'inhibition d'enzymes, l'ouverture de canaux membranaires et modulant le trafic intracellulaire. L'identification de protéines parternaires de la CaM requière la mise au point de techniques permettant de mesurer les paramètres de la liaison pour un grand nombre de protéines dans des conditions variables mimant l'environnement cellulaire (par exemple en présence de ligands ou d'autres protéines). Le premier objectif de cette thèse a été de développer une technique de mesure des interactions CaM-parternaire reposant sur des mesures d'anisotropie de fluorescence. Les tests ont été ensuite utilisés pour caractériser de manière quantitative l'interaction préalablement mise en évidence de deux protéines chloroplastiques (NADK2 et Tic32) avec la CaM. Afin d'identifier d'autres cibles chloroplastiques de la CaM nous avons alors effectué une analyse à haut-débit en couplant une purification par affinité à des analyses protéomiques. La validation des interactions a été réalisée grâce à l'utilisation de méthodes biochimiques complémentaires. Nous avons ensuite focalisé notre attention sur la protéine ceQORH dont la très forte affinité pour la CaM a pu être confirmée. Nos résultats fournissent par ailleurs de nouveaux éléments pour la compréhension de ces interactions. Afin de vérifier la présence de CaM ou de CaM-like (CML) dans le chloroplaste nous avons utilisé une approche biochimique et protéomique. Nous avons d'autre part étudié la localisation de CMLs potentiellement chloroplastiques fusionnées à la GFP dans des protoplastes d'Arabidopsis. A ce jour ces deux approches ne nous ont pas permis d'identifier ce type de protéines dans le chloroplaste.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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