La microscopie STED (stimulated emission depletion ou déplétion par émission stimulée) est une des méthodes les plus répandues de microscopie de super-résolution. Dans un microscope STED, un faisceau en anneau se superpose avec le faisceau d'excitation et éteint les fluorophores en périphérie du faisceau d'excitation par émission stimulée. Au centre de l'anneau, où le faisceau STED a une intensité nulle, la fluorescence reste intacte. Cette technique nécessite un montage complexe dans lequel deux faisceaux laser, en général issus de deux sources différentes, doivent être parfaitement alignés et superposés. Dans ce travail de thèse, nous proposons deux configurations STED qui ont pour but de simplifier le montage et de réduire le coût total d'un tel système. L'idée de base dans les deux cas est d'utiliser la même source laser à la fois pour l'excitation et la déplétion par émission stimulée. Dans la première configuration, nous avons développé une source bicolore originale basée sur un laser Nd-YAG microchip. Ce laser microchip délivre simultanément des impulsions sub- ns à deux longueurs d'onde, 355 nm (excitation) et 532 nm (déplétion), qui sont générés par conversion harmonique à partir d'une émission laser Nd-YAG et offrent l'avantage d'être intrinsèquement alignées et synchronisées. Afin de trouver des colorants appropriés pour cette source particulière, nous avons développé une méthode de caractérisation et testé différents colorants Nous avons construit un microscope à partir de cette source laser et obtenu des images avec une résolution améliorée. La réduction du volume d'excitation a été confirmée par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Cependant, les aberrations chromatiques des optiques utilisées limitent les performances du montage actuel. Une perspective prometteuse serait de combiner le STED à la microscopie à feuille de lumière (SPIM), plus tolérante des défauts d'achromatisme, et nous montrons les premiers résultats de cette approche. Dans la seconde configuration, les aberrations chromatiques ne sont plus un problème puisqu' une seule longueur d'onde est utilisée pour l'excitation (par absorption à deux photons) et la déplétion. En jouant sur la durée de l'impulsion (et donc la valeur de l'intensité crête), un de ces deux procédés peut être favorisé. La fluorescence est excitée à deux photons par une impulsion femtoseconde, puis est éteinte par émission stimulée à un photon avec une impulsion étirée. Nous avons utilisé une technique résolue en temps (Time-Correlated Single Photon Counting - TCSPC) pour étudier l'efficacité de déplétion du colorant DCM en solution. Les simulations numériques montrent que cette méthode peut être appliquée à la microscopie de super résolution. En fin de cette partie, nous présentons les premières images obtenues avec un microscope développé au laboratoire qui permet l'excitation à deux photons et la déplétion à un photon avec une seule longueur d'onde, ainsi que l' amélioration de la résolution observée. Dans ce travail, nous avons donc mis en place expérimentalement, pour la première fois, deux concepts destinés à simplifier en utilisant deux sources laser originales.