Multi-level characterization of monoclonal antibodies with a capillary electrophoresis-mass spectrometry coupling
Caractérisation d’anticorps monoclonaux à différents niveaux à l’aide d’un couplage électrophorèse capillaire – spectrométrie de masse
Abstract
Monoclonal antibodies (mAbs) are therapeutic biomolecules employed as treatment against cancer and other pathologies. These glycoproteins are subject to numerous micro-heterogeneities which cou Id affect treatment efficiency. Hence, mAbs variants analysis requires powerful, rapid and accurate analytical methods to elucidate their structure. ln this thesis, works have been done to develop methods leaning on a capillary electrophoresis - mass spectrometry coupling (CE-MS) to get a multi-level mAbs isoforms analysis. First, method assessment and validation of glycosylation forms analysis by CE-MS have been done to characterize and set up a relative quantitation of these modifications. ln order to avoid potential artifactual modifications due to the sample preparation process, higher order analyses have been performed at tougher analytical levels. For that purpose, methods involving partial and total enzymatic digestion have been developed and optimized to assess the plenty of post-translational modification linked to the protein structure. Finally, whole protein analyses have been completed to get a more accurate illustration from variants heterogeneity of the medication administered. The comprehensive analysis of mAbs and their variants should help to guide the manufacturing process and go a step further in treatment optimization.
Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des biomolécules complexes utilisées pour traiter divers cancers et autres pathologies. Ce sont des glycoprotéines qui possèdent de nombreuses micro hétérogénéités pouvant altérer l'efficacité des traitements. De ce fait, l'analyse de ces variants nécessite le développement de méthodes analytiques rapides et précises afin d'élucider la structure des mAbs. Les travaux présentés dans cette thèse portent sur le développement du couplage électrophorèse capillaire - spectrométrie de masse (CE-MS) afin d'obtenir une caractérisation des variants de mAbs à différents niveaux. D'abord, une validation de la méthode CE-MS au niveau bottom-up a été réalisée pour caractériser les structures des glycosylations et les quantifier relativement. Afin d'éviter les modifications artéfactuelles produites lors des étapes de préparation d' échantillon, des analyses ont été réalisées à des niveaux plus complexes de ces molécules. Pour cela, des méthodes ont été développées afin d'analyser les mAbs partiellement digérés via une enzyme spécifique pour confirmer les résultats et obtenir une répartition des modifications post traductionnelles. Enfin, des séparations des mAbs intacts ont été effectuées afin d'avoir une représentation la plus proche possible de la répartition des variants dans les échantillons. La caractérisation fine des variants permettra alors d'orienter les processus de fabrication des mAbs afin d'optimiser les traitements.
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