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Theses Year : 2019

Design of galactofuranosyl-specific neolectins : bioengineering, imaging and diagnosis

Mise au point de NéoLectines spécifiques des furanosides : bioingénierie, diagnostic et imagerie

Abstract

Specific targeting of viral and bacterial infections is of major importance for early diagnosis of many diseases. Galactofuranose (Galf) is absent in humans but is found as glycoconjugate moiety in a large number of human pathogens (Aspergillus, Leishmania, Trypanosoma, Mycobacterium) thus offering possibilities to target this carbohydrate in biotechnological applications using enzymes involved it its metabolism (UDP-galactopyranose mutase (UGM), Galactofuranosyl transferase (GalfT), Galactofuranosidase (Galf-ase). Recently, the first Galf-specific enzyme from Streptomyces spp. and gene encoding it has been reported.This thesis work focuses on Galf-ase and consists of three main parts. First part is groundwork characterization of this enzyme including subcloning, overexpression, purification and kinetic characterized (kcat, KM, kcat,/KM). Also, determination of optimum activity (pH and temperature) and storage stability conditions.Second part consists of applying enzyme engineering technology (site-directed mutagenesis) to generate neolectins (carbohydrate-binding proteins) from the wild-type. Several mutant Galf-ase enzymes have been overexpressed, purified and kinetically characterised (kcat, KM, kcat,/KM) on their potential to be used as neolectins and thioglycoligases for furanothioglycoside synthesis.Final, third part focuses on procedures in order to create luminescent nanoparticle scaffold to bear lanthanide complexes and to bind Galf-ase neolectins onto its surface. The resulting luminescent conjugates were tested as probes in near-infrared optical imaging of Galf located on the surface of microorganisms.
Le ciblage spécifique des infections virales et bactériennes revêt une importance majeure pour le diagnostic précoce de nombreuses maladies. Le galactofuranose (Galf) est absent chez l'homme mais se trouve en tant que fragment de glycoconjugués dans un grand nombre d'agents pathogènes pour les Hommes (Aspergillus, Leishmania, Trypanosoma, Mycobacterium), offrant ainsi la possibilité de cibler ce sucre dans des applications biotechnologiques utilisant des enzymes impliquées dans son métabolisme (UDP-galactose), mutase (UGM), galactofuranosyl transférase (GalfT), galactofuranosidase (Galf-ase). Récemment, la première enzyme spécifique du Galf de Streptomyces spp. et son gène codant ont été rapportés.Ce travail de thèse se concentre sur Galf-ase et se compose de trois parties principales. La première partie concerne la caractérisation de cette enzyme, y compris le sous-clonage, la surexpression, la purification et la cinétique (kcat, KM, kcat,/KM), la détermination de l'activité optimale (pH et température) et de la stabilité au stockage.La deuxième partie consiste à appliquer une technologie d'ingénierie enzymatique (mutagenèse dirigée par site) pour générer des néolectines (protéines de reconnaissance des sucres) à partir du type sauvage. Plusieurs enzymes Galf-ase mutantes ont été surexprimées, purifiées et caractérisées cinétiquement (kcat, KM, kcat,/KM) pour leur potentiel d'utilisation en tant que néolectines et thioglycoligases pour la synthèse de furanothioglycosides.La troisième et dernière partie porte sur les procédures à suivre pour créer des nanoparticules luminescentes destinées à contenir des complexes de lanthanides et à lier les néolectines de Galf-ase à sa surface. Les conjugués luminescents résultants ont été testés en tant que sondes dans l'imagerie optique proche infrarouge de Galf située à la surface de microorganismes.
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Dates and versions

tel-03131503 , version 1 (04-02-2021)

Identifiers

  • HAL Id : tel-03131503 , version 1

Cite

Mateja Senicar. Mise au point de NéoLectines spécifiques des furanosides : bioingénierie, diagnostic et imagerie. Sciences agricoles. Université d'Orléans, 2019. Français. ⟨NNT : 2019ORLE3037⟩. ⟨tel-03131503⟩
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