Probing living cells by terahertz Attenuated Total Reflection : permeabilization dynamics of the cell membrane
Sonder les cellules vivantes par Réflexion Totale Atténuée térahertz : dynamique de perméabilisation de la membrane cellulaire
Résumé
Terahertz radiation is located in the electromagnetic range between far infrared and microwaves, corresponding to frequencies between 0.1 and 10 THz. This spectral range is currently largely under-exploited, but its application to the study of biological objects has already shown a strong potential, in the detection of skin cancer, ion flow monitoring or biosensors. In the field of biology, which is of particular interest to us here, the terahertz range makes it possible to quantify and discriminate solutes of biological interest thanks to the interaction with low-frequency modes of liquid water, and thus to study biomolecules, microorganisms and cells in their physiological environment. The first part of this thesis work consisted in studying the dynamics of membrane permeabilization of living cells by attenuated total reflection (ATR) with our device based on a femtosecond laser and the generation of ultrashort terahertz pulses. Monolayers of MDCK epithelial cells were exposed to varying concentrations of saponin, a detergent that digs holes in the cell membrane. The dynamics obtained were then compared to a theoretical model describing the physical behavior of the cell layer, taking into account the diffusion of detergent molecules and the physical characteristics of the membrane. The good agreement between experiment and theory indicates that membrane permeabilization is limited mainly by the diffusion of detergent molecules and their binding to the membrane.In a second part, we developed a completely new system based on a continuous terahertz QCL source at 2.5 THz. This new instrument is based on a very simplified design, with a single ATR prism and a single detector, and on the dual modulation of the terahertz beam using a mechanical chopper. This chopper synchronizes the dual modulation and defines the measurement and reference zones. The long-term stability of this device has been greatly enhanced by the precise control of temperature and humidity inside the device. Performance is excellent in both the short and long term. A signal-to-noise ratio of 30 dB is achieved over 300ms, and remains above 30 dB for several hours. In addition, a theoretical and experimental study has been carried out to calibrate the instrument. Thus, the ATR reflection coefficients of several solutions of biological interest (ions, sugars and proteins) were obtained over a wide range of concentrations. A sensitivity at least 20 times higher than that of the existing literature was thus obtained. Thanks to this new high-performance system, we studied the dynamics of membrane permeabilization following the action of photodynamic therapy (PDT). The first results showed that the encapsulation of photosensitizers by micellar vectors significantly improves the efficiency of PDT.
Le rayonnement térahertz se situe dans la gamme électromagnétique entre l'infrarouge lointain et les micro-ondes, correspondant à des fréquences comprises entre 0.1 et 10 THz. Cette zone spectrale est à l'heure actuelle très largement sous-exploitée, mais son application à l’étude d’objets biologiques a déjà montré un fort potentiel, dans la détection de cancers de la peau, le suivi de flux ioniques ou les biosenseurs. Dans le domaine de la biologie, qui nous intéresse particulièrement ici, la gamme des térahertz permet de quantifier et de discriminer des solutés d'intérêt biologique grâce à l'interaction avec les modes basse fréquence de l'eau liquide, et donc d'étudier les biomolécules, les microorganismes et les cellules dans leur environnement physiologique. La première partie de ce travail de thèse a consisté à étudier la dynamique de perméabilisation membranaire de cellules vivantes par réflexion totale atténuée (ATR) avec notre dispositif basé sur un laser femtoseconde et la génération d’impulsions térahertz ultracourtes. Des monocouches de cellules épithéliales MDCK ont été soumises à des concentrations variables de saponine, un détergent creusant des trous dans la membrane cellulaire. Les dynamiques obtenus ont ensuite été comparées à un modèle théorique décrivant le comportement physique de la couche cellulaire, et prenant en compte la diffusion des molécules de détergent ainsi que les caractéristiques physiques de la membrane. Le bon accord entre expérience et théorie nous indique que la perméabilisation membranaire est limitée principalement par la diffusion des molécules de détergent et leur fixation dur la membrane.Dans un second temps, nous avons développé un système totalement nouveau, basé sur une source QCL continue térahertz à 2,5 THz. Ce nouvel instrument est basé sur une conception très simplifiée, avec un seul prisme ATR et un seul détecteur, et sur une double modulation du faisceau térahertz à l'aide d'un hacheur mécanique. Ce hacheur synchronise la double modulation et définis les zones de mesure et de référence. La stabilité à long terme de cet appareil a été grandement améliorée grâce au contrôle précis de la température et de l'humidité à l'intérieur de l'appareil. Les performances sont excellentes tant à court terme qu'à long terme. Un rapport signal/bruit de 30 dB est obtenu sur 300ms, et il reste supérieur à 30 dB pendant plusieurs heures. En outre, une étude théorique et expérimentale a permis de calibrer l'instrument. Ainsi, les coefficients de réflexion ATR de plusieurs solutions d'intérêt biologique (ions, sucres et protéines) ont été obtenus sur une large gamme de concentrations. Une sensibilité au moins 20 fois supérieure à celle de la littérature existante a ainsi été obtenue. Grâce à ce nouveau système très performant, nous avons étudié la dynamique de la perméabilisation des membranes suite à l'action de la thérapie photodynamique (PDT). Les premiers résultats ont montré que l'encapsulation des photosensibilisateurs par des vecteurs micellaires améliore significativement l'efficacité de la PDT.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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