The DNA methylation of the snail Biomphalaria glabrata, role and impact on the generation of phenotypic plasticity
La méthylation de l'ADN chez Biomphalaria glabrata, rôle et impact sur la génération de la plasticité phénotypique
Résumé
The understanding of the molecular mechanisms that allows the rapid adaptation of mollusks that are vector of parasites, to new environments is important for disease control. Rapid adaptation is difficult to explain by traditional Mendelian genetics and there is strong evidence supporting that epigenetic mechanisms, are behind rapid adaptations in other species. I studied one epigenetic mark called DNA methylation that has demonstrated to be environmentally modulated and to play a role in phenotypic plasticity in many species, principally plants and vertebrates. Nevertheless, the role of DNA methylation in generating phenotypic variation in invertebrates has been poorly studied. I addressed the question of the role of DNA methylation in the generation of phenotypic plasticity and its heritability in the snail Biomphalaria glabrata, the intermediate host of the parasite Schistosoma mansoni, the causal agent of schistosomiasis, a neglected tropical disease. DNA methylation in B. glabrata has been found to be modulated by the infection of the parasite S. mansoni and by environmental stress, furthermore, it was demonstrated that DNA methylation affects its gene expression, suggesting that DNA methylation can affect phenotypic variation and therefore the adaptation of the snail to new environments. To study the role of DNA methylation in the generation of phenotypic variation, experimental manipulation of the DNA methylation in the snail was necessary. Therefore, two approaches were proposed in this thesis to introduce epimutations in the snail B. glabrata: 1) Random epi-mutagenesis using chemical DNA methyltransferase (DNMT) inhibitors and by consequent segregation of epimutations in self-fertilization lines and 2) Methylate the cytosines of a targeted locus with a targeted epigenome editing tool consisting in the use of the DNA methyltransferase (DNMT3) construct fused to the nuclease-inactivated dCas9. For the random epi-mutagenesis approach, a novel DNMT inhibitor has shown methylation inhibiting effects in two subsequent generations, showing a2multigenerational epigenetic effect and without showing toxic effects in either survival nor fecundity of the snail B. glabrata. In addition, the inhibitor Flv1 has been shown to be effective in other two mollusk species, the freshwater snail Physa acuta and the pacific oyster Crassostrea gigas, which suggests that this inhibitor represents a molecular tool to modulate the methylation of DNA in other mollusks. In the case of the targeted epimutagenesis approach, I used a transfection method that allows introducing two plasmid vectors with an SV40 viral promoter in vivo in embryos of the snail B. glabrata. The transfection was performed at the gastrula stage, which resulted in mosaic incorporation of the vector into the transfected cells. However, the method was able to methylate some CpG sites of the targeted gene.
La compréhension des mécanismes moléculaires qui permettent l'adaptation rapide des mollusques vecteurs de parasites à de nouveaux environnements est importante pour le contrôle des maladies. L'adaptation rapide est difficile à expliquer par la génétique mendélienne traditionnelle et il existe des preuves solides qui soutiennent que les mécanismes épigénétiques sont à l'origine des adaptations rapides chez plusieurs espèces. Je me suis focalisée sur une marque épigénétique appelée la méthylation de l’ADN, qui est modulée par l'environnement et joue un rôle dans la plasticité phénotypique chez de nombreuses espèces, principalement les plantes et les vertébrés. Néanmoins, le rôle de la méthylation de l'ADN dans la génération de variations phénotypiques chez les invertébrés a été très peu étudié. J'ai abordé la question du rôle de la méthylation de l'ADN dans la génération de la plasticité phénotypique et de son héritabilité chez l'escargot B. glabrata, l'hôte intermédiaire du parasite Schistosoma mansoni, l'agent pathogène de la schistosomiase, une maladie tropicale négligée. La méthylation de l'ADN chez B. glabrata est régulée par l'infection3du parasite S. mansoni et par le stress environnemental, de plus, il a été démontré que la méthylation de l'ADN affecte son expression génique, suggérant que la méthylation de l'ADN peut affecter la variation phénotypique et donc l'adaptation de l'escargot à de nouveaux environnements. Pour étudier le rôle de la méthylation de l'ADN dans la génération de la variation phénotypique, une manipulation expérimentale de la méthylation de l'ADN chez l'escargot était nécessaire. Par conséquent, deux approches ont été proposées dans cette thèse pour introduire des épimutations chez l'escargot B. glabrata: 1) Épi-mutagenèse aléatoire en utilisant des inhibiteurs chimiques des enzymes ADN methyltransferases (DNMT) et par ségrégation conséquente des épimutations dans des lignées d'autofécondation et 2) Par la méthylation des cytosines d'un locus ciblé avec un outil d'édition épigénétique qui consiste à l'utilisation d'une vecteur plasmidique codant pour l’ADN méthyltranférase (DNMT3) fusionnée avec l’enzyme dCas9 (Cas9 avec l’activité nucléase désactivé). Pour l’approche d’épimutagenèse aleatoire, un nouvel inhibiteur des enzymes DNMT a montré des effets d’inhibition de la méthylation dans deux générations consécutives, en montrant un effet épigénétique multigénérationnelle et sans montrer d’effet toxique ni dans la survie ni dans la fécondité de l’escargot B. glabrata. De plus l’inhibiteur Flv1 a montré être efficace dans deux autres espèces de mollusques, l’escargot d’eau douce Physa acuta et l’huître creuse Crassostrea gigas, ce qui suggère que cet inhibiteur représente un potentiel outil moléculaire pour moduler la méthylation de l’ADN chez d’autres mollusques. Dans le cas de l’approche ciblée, j’ai utilisé une méthode de transfection qui permet d’introduire deux vecteurs plasmidiques avec un promoteur viral SV40 de façon in vivo dans des embryons de l’escargot B. glabrata. La transfection a été effectuée au stade gastrula, ce qui a entrainé une incorporation mosaïque du vecteur dans les cellules transfectées. Toutefois, la méthode a permis de méthyler certains sites CpG du gène ciblé.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
|---|