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Thèse Année : 2021

Mechanistic dissection of SPEN function during X chromosome inactivation

Fonctions et mécanismes de SPEN pendant l’inactivation du chromosome X

Résumé

In female placental mammals, dosage compensation of X-linked gene expression is achieved early during development through transcriptional inactivation of one of the two X chromosomes (XCI). This process is dependent on Xist, a long non-coding RNA which coats and silences the X chromosome from which it is transcribed. The mechanisms through which Xist initiates transcriptional silencing during XCI remain however completely unknown. In 2015, several studies identified that the SPEN protein binds Xist RNA directly, and its implication in mediating gene silencing was reported. However, its precise function and mechanism(s) of action during XCI are unclear.During my PhD, I made use of a conditional loss of function approach, the auxin inducible degron, to acutely deplete SPEN in mouse embryonic stem cells (mESCs) undergoing XCI. Using this approach, I demonstrate that SPEN is absolutely necessary for chromosome-wide Xist-mediated gene silencing during initiation of XCI. Furthermore, using conditional Spen KO mouse embryos, I show that SPEN is also required for the transcriptional inactivation of the paternal X chromosome during imprinted X inactivation. Depleting SPEN in differentiated cells, in which XCI has been established, reveals that SPEN is neither required to maintain gene silencing nor to preserve the spatial organization of the inactive X chromosome.By combining fixed and live cell imaging of Xist and SPEN, I show that SPEN colocalizes with Xist RNA, and accumulates on the X chromosome, immediately upon Xist upregulation, suggesting that SPEN can initiate gene silencing very early on during XCI. Profiling SPEN chromatin binding sites reveals that SPEN is recruited to promoters and enhancers of active genes specifically. The magnitude of SPEN recruitment to X-linked promoters dictates the efficiency with which these genes will be silenced. Remarkably, SPEN disengages from chromatin after gene silencing, indicating that active transcription required for SPEN’s association with chromatin.Using a functional complementation approach, I identify the SPOC domain as the effector of SPEN’s gene silencing activity during XCI. Artificial tethering of SPOC to Xist RNA results in transcriptional repression along the entire X chromosome, demonstrating that SPOC contains all the sufficient potential to instruct gene silencing during XCI. I further characterize the protein interactors of SPOC using mass spectrometry and reveal that SPOC interacts with several protein complexes involved in repressing transcription, including the NCoR/SMRT (histone deacetylation), the NuRD (nucleosome remodeling/histone deacetylation) and the m6A writing (governing mRNA fate) complexes. Finally, several transcription initiation and elongation factors are found to interact with SPOC, as well as the RNA polymerase II (RNAPII) transcription machinery.I identify that SPOC interacts directly and specifically with the C-terminal domain (CTD) of RNAPII only when the latter is phosphorylated on Ser5, and determine the 3D structure of the SPOC/RNAPII-CTD Ser5-P complex at 1.8Å resolution. These results suggest that SPEN could directly repress transcription during XCI by interfering with RNAPII-CTD Ser5-P templated processes.Altogether, my PhD work reveals that SPEN is essential for chromosome-wide transcriptional silencing during XCI, both in mESCs and in vivo. Following Xist upregulation, SPEN is immediately recruited to active gene promoters and enhancers, silences transcription, and subsequently disengages from chromatin. Through its RRMs and SPOC domains, SPEN acts as a molecular integrator, bridging Xist with histone deacetylases, nucleosome remodelers, RNA methyltransferases and most importantly, the transcription machinery.
Chez les mammifères placentaires femelles, la transcription d’un des deux chromosomes X est inactivée (ICX) au cours du développement embryonnaire. Cette inactivation est permise par Xist, un ARN non-codant qui recouvre le chromosome X à partir duquel il est exprimé, induisant ensuite l’extinction transcriptionnelle de tout ce chromosome. Les mécanismes moléculaires par lesquels Xist permet une telle répression des gènes liés à l’X demeurent globalement incompris. En 2015, la protéine SPEN a été identifiée comme interagissant directement avec l’ARN de Xist, mais sa fonction précise ainsi que son mécanisme d’action au cours de l’ICX restaient à découvrir.Au cours de mon travail de thèse, j’ai utilisé la technique du dégron inductible à l’auxine, une approche de type perte de function, permettant de dégrader SPEN à façon dans des cellules souches embryonnaires de souris (CSES) en cours d’ICX. Grâce à cette technique, je démontre que SPEN est absolument necessaire pour la repression transcriptionnelle de tout le chromosome X pendant l’ICX. Aussi, en ayant recours à des embryons de souris Spen KO, je montre que SPEN is tout autant essentiel pour l’inactivation du chromosome X paternel au cours de l’ICX soumise à empreinte. En revanche, la perte de SPEN dans des cellules différenciées, où l’ICX est déjà établie, révèle que SPEN n’est plus requis ni pour maintenir les gènes éteints, ni pour préserver l’organisation tridimensionnelle du chromosome X inactif.Par des approches de microscopie en cellules vivantes, je rapporte ensuite que SPEN est colocalisé avec l’ARN de Xist immédiatement après l’expression de ce dernier, suggérant que SPEN peut initier la répression transcriptionnelle très tôt pendand l’ICX. La caractérisation des sites de liaisons de SPEN à la chromatine révèle que SPEN est recruté uniquement au niveau des promoteurs et des enhancers des gènes actifs. Aussi, la magnitude du recrutement de SPEN aux promoteurs liés à l’X prédit la rapidité avec laquelle les gènes sont inactivés au cours de l’ICX. Enfin, une fois les genes inactivés, SPEN se dissocie de la chromatine, ce qui indique qu’une activité transcriptionnelle est requise pour l’association de SPEN à la chromatine.Par complémentation fonctionnelle, le domaine SPOC est identifié comme l’effecteur principal de l’activité répressive de SPEN pendant l’ICX, et le recrutement « forcé » de SPOC sur l’ARN de Xist suffit à entraîner l’inactivation des gènes à l’échelle du chromosome entier. L’identification de l’interactome protéique de SPOC par spectrométrie de masse révèle que SPOC interagit avec de nombreux complexes impliqués dans la répression transcriptionnelle : NCoR/SMRT (désacétylation des histones), NuRD (remodelage de la chromatine et désacétylation des histones) et la machinerie de méthylation m6A des ARN, ainsi qu’avec la machinerie de transcription (Pol2).En utilisant des approches de biophysique et de biologie structurale, je montre que SPOC interagit directement et spécifiquement avec le domaine C-terminal (CTD) de Pol2, seulement quand ce dernier est phosphorylé sur la Sérine 5. Ces résultats suggèrent que SPEN peut réprimer la transcription directement en interférant avec les évènements transcriptionnels dépendant de Pol2-CTD Ser5P.Ainsi, mon travail de these souligne l’essentialité de SPEN pour éteindre la transcription à l’échelle du chromosome X entier au cours de l’ICX, aussi bien in vitro que in vivo. Immédiatement après l’expression de Xist, SPEN est recruté aux promoteurs et enhancers de gènes actifs, réprime la transcription, puis se dissocie de la chromatin une fois les gènes éteints. Grâce à ses domaines RRMs et SPOC, SPEN joue un rôle d’intégrateur, asociant Xist à des désacétylases des histones, des remodeleurs de la chromatine, mais surtout, à la machinerie de transcription.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03240606 , version 1 (28-05-2021)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03240606 , version 1

Citer

François Dossin. Mechanistic dissection of SPEN function during X chromosome inactivation. Genetics. Université Paris sciences et lettres, 2021. English. ⟨NNT : 2021UPSLS042⟩. ⟨tel-03240606⟩
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