Phylogenic study of equid alphaherpesvirus strains isolated in France and development of an innovative assay for the measurement of neutralising antibodies after infection or vaccination
Étude phylogénique de souches d'alphaherpèsvirus isolées chez les équidés français et développement d'un outil innovant pour la mesure des anticorps neutralisants après infection ou vaccination
Résumé
The equine herpesvirus 1 (EHV-1) is classified among the Herpesviridae and is one of the most frequently encountered pathogens in the equine population. This virus can cause a respiratory form of disease, abortion or still-birth, an ocular form of disease or a nervous form of disease that can lead to euthanasia of the animal. Prevention measures including vaccination are the primary barrier against the virus. In case of an epizootic, the tracking and identification of the strains can be a precious help to understand infection mechanisms. This thesis work focused on the molecular monitoring of a population of EHV-1 strains isolated in France between 2009 and 2018 using different approaches. The typing of 137 EHV-1 strains for the polymorphism in position 2254 of the DNA polymerase gene (ORF30) associated with the pathogenicity of the strains showed a significant association of the A2254 genotype with abortion cases. Fourteen strains of interest were then analysed using ORF30 sequencing and Multi Locus Sequence Typing (MLST). Complete ORF30 sequencing resulted in poor discrimination but allowed a third genotype (C2254 (H752)) to be identified in position 2254 of the ORF30. MLST analysis allowed classifying these strains among 7 of the 10 UL clades described with this tool to date. Two other equid herpesvirus strains, one EHV-8 and one EHV-9, were identified using ORF30 sequencing. These different strains of equid alphaherpesviruses were characterised, compared and their sensitivity towards seven antiviral molecules was evaluated in vitro. Their genetic proximity could be visualised in a phylogenetic network based on the ORF30 sequences. A second part of the work focused on monitoring the level of protection conferred by EHV-1 neutralizing antibodies. An innovative quantification assay was developed using the xCELLigence® technology on E. Derm cells and allowed to determine the titres inducing 50% of the neutralisation of a virus concentration (NT50) from a population of qualified serum samples taken during an experimental infection with the EHV-1 C2254 strain. The NT50 values obtained were correlated with the titre values obtained with the reference method on RK13 cells. The response of a horse population to vaccination was then studied according to the vaccination protocol received and the history of the horses.
L’herpèsvirus équin 1 (EHV-1), classé parmi les Herpesviridae, est l’un des pathogènes les plus fréquemment rencontrés au sein de la population équine. Ce virus peut être à l’origine de formes de maladie respiratoire, abortive ou néonatale, oculaire ou nerveuse pouvant conduire à l’euthanasie de l’animal. Les mesures de prévention incluant la vaccination constituent la première barrière dans la lutte contre ce virus. En cas d’épizootie, le suivi et l’identification des souches peuvent constituer une aide précieuse pour la compréhension des modes d’infection. Ce travail de thèse a porté sur le suivi moléculaire par différentes approches d’une population de souches d’EHV-1 isolées en France entre 2009 et 2018. Le typage de 137 souches d’EHV-1 pour le polymorphisme en position 2254 du gène de l’ADN polymérase (ORF30) associé à la pathogénicité des souches a montré une association significative des souches de type A2254 avec les cas d’avortements. Quatorze souches d’intérêt ont ensuite été analysées par séquençage de l’ORF30 et Multi Locus Sequence Typing (MLST). Le séquençage complet de l’ORF30 s’est montré peu discriminant mais a permis de mettre en évidence un troisième génotype (C2254 (H752)) en position 2254 de l’ORF30. L’analyse par MLST a permis de classer ces souches parmi 7 des 10 clades UL décrits par l’outil à ce jour. Deux autres souches d’herpèsvirus d’équidés, une d’EHV-8 et une d’EHV-9, ont pu être mises en évidence grâce au séquençage de l’ORF30. Ces différentes souches d’alphaherpèsvirus des équidés ont été caractérisées, comparées et leur sensibilité vis-à-vis de sept molécules antivirales a été évaluée in vitro. Leur proximité génétique a pu être visualisée par la construction d’un network phylogénétique basé sur les séquences de l’ORF30. Une seconde partie du travail a porté sur le suivi du niveau de protection conféré par les anticorps neutralisant l’EHV-1. Une technique innovante de quantification a été mise au point grâce à la technologie xCELLigence® sur cellules E. Derm et a permis de déterminer les titres induisant 50% de la neutralisation d’une concentration de virus (NT50) à partir d’une population d’échantillons qualifiés provenant d’une infection expérimentale avec la souche d’EHV-1 C2254. Les valeurs de NT50 obtenues ont montré une bonne corrélation avec les valeurs de titres obtenues avec la méthode de référence sur cellules RK13. Les réponses de chevaux à la vaccination ont ensuite pu être étudiées selon le protocole de vaccination reçu et selon l’historique des chevaux.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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