Capillary electrophoresis and Taylor dispersion analysis for the study of antigen / adjuvant interactions in vaccine products and the characterization of messenger RNA vaccine formulations
Electrophorèse capillaire et analyse de la dispersion de Taylor pour l’étude des interactions antigènes/adjuvants dans les vaccins et la caractérisation des formulations vaccinales à ARN messager
Résumé
This thesis project aims to develop new analytical methods to characterize vaccine formulations.The first objective was to evaluate the performance of capillary electrophoresis (CE) and Taylor's dispersion analysis (TDA) for the study of antigen-adjuvant interactions in vaccine products. As these interactions can have a significant impact on the immune response, the development of a vaccine candidate involves the precise study of antigen-adjuvant mixtures and their potential interactions. First, the study of the interactions between an anionic polymeric adjuvant (polyacrylic acid, SPA09), and a cationic vaccine antigen under development for the treatment of Staphylococcus aureus was carried out by frontal analysis continuous capillary electrophoresis (FACCE). The FACCE methodology provided direct access to the percentage of free antigens and to the average number of antigens bound per adjuvant. Which allowed to plot the adsorption isotherms and determine the interaction constants. TDA subsequently allowed to go further and determine the size of the antigen-adjuvant complexes under physiological conditions and also to access the interaction constants. The mean hydrodynamic radii (Rh) of the complexes obtained by TDA were confirmed by those measured by transmission electron microscopy (TEM) and the interaction parameters measured by TDA were of the same order of magnitude as those previously obtained by FACCE. Finally, capillary zone electrophoresis (CZE) allowed to study antigen/adjuvant interactions in the context of vaccines containing mixtures of several antigens. The methodology developed by CZE made it possible to separate three strains of inactivated poliovirus, without denaturing them, and to study their interaction with aluminum oxyhydroxide (AlOOH).The second objective of this thesis was to develop new analytical methods for the characterization of messenger RNA (mRNA) vaccine formulations. In this context, a method for analyzing the size and the size distribution of LNPs and mRNA has been developed by TDA. A comparison between the sizes obtained by TDA and by dynamic light scattering (DLS) was carried out and the two methods were found to be complementary. Thus, TDA methodology could be used to study different formulation parameters impacting the size of LNPs. Subsequently, TDA was also used to study the degradation of mRNA in the presence of ribonucleases (RNases) and to determine the encapsulation efficiency of mRNA within the LNPs as well as the size of the encapsulated mRNA. Finally, TDA also provided easy access to the viscosity of the LNP formulations and CE allowed the determination of the surface charge density of the LNPs.
Ce projet de thèse vise à développer de nouvelles méthodes analytiques pour caractériser les formulations vaccinales.Le premier objectif a été d’évaluer les performances de l’électrophorèse capillaire (CE) et de l’analyse de la dispersion de Taylor (TDA) pour l’étude des interactions antigènes-adjuvants dans les vaccins. Comme ces interactions peuvent avoir un impact significatif sur la réponse immunitaire, le développement d’un candidat vaccin implique l’étude précise des mélanges antigènes-adjuvants et de leurs potentielles interactions. Premièrement, l’étude des interactions entre un adjuvant polymérique anionique (acide polyacrylique, SPA09), et un antigène vaccinal cationique en développement pour le traitement du staphylocoque doré a été réalisée par analyse frontale continue en électrophorèse capillaire (FACCE). La FACCE a permis d’accéder directement au pourcentage d'antigènes libres et au nombre moyen d'antigènes liés par adjuvant. Ce qui a permis de tracer les isothermes d'adsorption et déterminer les constantes d’interactions. La TDA a par la suite permis d’aller plus loin et de déterminer la taille des complexes antigène-adjuvant dans des conditions physiologiques et également d’accéder aux constantes d’interactions. Les rayons hydrodynamiques moyens (Rh) des complexes obtenus par TDA ont été confirmés par ceux mesuré par microscopie électronique en transmission (TEM) et les paramètres d’interaction mesurés par TDA étaient du même ordre de grandeur que ceux précédemment obtenus par FACCE. Enfin, l’électrophorèse capillaire de zone (CZE) a permis d’étudier des interactions antigènes-adjuvants dans le cadre de vaccins contenant des mélanges de plusieurs antigènes. La méthodologie développée par CZE a permis de séparer trois souches de poliovirus inactivé, sans les dénaturer, et d’étudier leur interaction avec l'oxyhydroxyde d'aluminium (AlOOH).Le second objectif de cette thèse a été de développer de nouvelles méthodes analytiques pour la caractérisation des formulations vaccinales à ARN messager (ARNm). Dans ce context, une méthode d’analyse de la taille et de la distribution en taille des LNPs et des ARNm a été développée par TDA. Une comparaison entre les tailles obtenues par TDA et par diffusion dynamique de la lumière (DLS) a été réalisé et les deux méthodes se sont avéré être complémentaires. Ainsi, la TDA a pu être employée pour étudier différents paramètres de formulations impactant la taille des LNPs. Par la suite, la TDA a également été utilisée pour étudier la dégradation de l'ARNm en présence de ribonucléases (RNases) et pour déterminer l’efficacité d'encapsulation de l'ARNm dans les LNPs ainsi que la taille de l'ARNm encapsulé. Enfin, la TDA a permis également d’accéder facilement à la viscosité des formulations de LNPs et la CE permis de déterminer la densité de charge surfacique des LNPs.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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