Identification et caractérisation de nouveaux lipopeptides bactériens par spectrométrie de masse - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2021

Identification and characterization of new bacterial lipopeptide by mass spectrometry

Identification et caractérisation de nouveaux lipopeptides bactériens par spectrométrie de masse

Résumé

Numerous studies have highlighted the involvement of intestinal microbiota in the physiology and pathophysiology of the host. Among probiotic bacteria, Escherichia coli Nissle 1917 (EcN 1917) has been described for its analgesic properties. The study of EcN 1917 lipids extract by high-resolution mass spectrometry permit to identify C12AsnGABA, a lipopeptide that its synthesizes by bacteria pks island. In vivo, this compound is able to inhibit visceral hypersensitivity: this bacterial lipids show analgesic properties. In order to determine if it belongs to a new lipid family, we extended the analysis to several bacterial species and develop an analytical workflow. This one combine a specific lipopeptides extraction and a specific lipopeptides analysis in liquid chromatography coupled with high-resolution tandem mass spectrometry and is constituting by several interconnected and essential steps having been optimized separately. Twenty-three new bacterial lipids has been identified, and characterized. Usually, the structural elucidation of new compounds is carried out by electro-nebulization combined with tandem mass spectrometry after fragmentation by collision-induced dissociation. During my thesis, resonant and non-resonant activation modes were combined to distinguish consecutive losses from competitive losses for a better understanding of their fragmentation mechanisms. Among the obtains results, unexpected fragment ions were discovered and were study. The evolution of the relative abundance of the ions from the CID spectrum in non-resonant mode as a function of the collision energy (ERMS curves) shows for the first time Gaussian profiles which can be broad or composites which seem to be independent of the mass spectrometer. This behavior, that has never been describe, bring up questions about the origin of the fragmentation mechanisms of these product ions. We considered the possibility that two reaction paths could permit the formation of the same fragment product ion for the board Gaussian curves. For the composite curves, we assume that two fragmentation reactions could occur: the first at low energy and the second at higher energy, each leading the formation of two isomers ions. These mechanisms of fragmentation have been confirmed by quantum calculations, and experimental evidences of isomeric ions formation is provided by cyclic ion mobility analysis coupled with mass spectrometry. This work allows the identification of twenty-three new lipids, produced by the intestinal microbiota. The structural characterization allows us to identify unexpected fragmentation behaviors as the regeneration of fatty acids that has never been describe before. We have proposed two fragmentation mechanisms that could explain the formation of two isomers for the shapes of the ERMS curves, for the composites curves.
De nombreuses études ont démontrées l'implication du microbiote intestinal dans la physiologie et la physiopathologie de l'hôte. Parmi les bactéries probiotiques, Escherichia coli Nissle 1917 a été décrite pour ses propriétés analgésiques. L'étude d'extraits lipidiques de cette bactérie par spectrométrie de masse à haute résolution a permis d'identifier le C12AsnGABA, un lipopeptide qu'elle synthétise via son ilot pks. In vivo, le C12AsnGABA est capable d'inhiber l'hypersensibilité viscérale. Ce lipopeptide bactérien possède donc des propriétés analgésiques. Afin de déterminer si le C12AsnGABA appartient à une nouvelle famille lipidique, nous avons étendu l'analyse à plusieurs espèces bactériennes et mis en place un workflow analytique de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem à haute résolution spécifique aux lipopeptides. Celui-ci, comprend plusieurs étapes interconnectées entres-elles et indispensables ayant été optimisées séparément. Vingt-trois nouveaux lipides bactériens ont ainsi pu être caractérisés. Classiquement, l'élucidation structurale de ces composés est réalisée en électrospray à l'aide de la spectrométrie de masse en tandem après de la fragmentation par dissociation induite par collision. Lors de ma thèse, nous avons combiné les modes d'activation résonnant et non résonnant afin de mettre en évidence les pertes consécutives et les pertes directes pour permettre une meilleure compréhension des mécanismes de fragmentations impliqués. Parmi les résultats obtenus, des ions fragments produits inattendus ont été découverts et ont fait l'objet d'une seconde étude. Les courbes d'évolutions des profils en fonction de l'énergie ont été réalisées et ont permis de mettre en évidence pour la première fois la présence de courbes Gaussiennes élargies et de courbes multi-composites. Ce comportement, jamais décrit auparavant, questionne sur l'origine de ces processus qui semblent être indépendant de l'instrumentation. Nous avons considéré la possibilité que deux chemins réactionnels puissent mener à la formation d'un même ion produit fragment dans le cas des courbes Gaussiennes élargies. Dans le cas des courbes composites, nous avons émis l'hypothèse que deux chemins réactionnels, le premier à basse énergie et le second à plus haute énergie menait chacun à la formation d'un ion de structure différente mais de masse identique. Par des analyses de mobilité ionique cyclique couplée à de la spectrométrie de masse et des calculs quantiques, nous avons pu confirmer nos hypothèses. Ces travaux de thèse ont permis d'identifier 23 nouveaux composés produits par le microbiote intestinal. Leur caractérisation structurale nous a permis de d'identifier des comportements de fragmentation inattendu générant des ions fragments d'acides gras jamais décrits. Nous avons démontré que deux chemins réactionnels pouvaient exister pour générer deux ions produits de même rapport masse sur charge mais de structures différentes, se traduisant par des courbes composites.
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Origine : Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03653778 , version 1 (28-04-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03653778 , version 1

Citer

Amandine Hueber. Identification et caractérisation de nouveaux lipopeptides bactériens par spectrométrie de masse. Physiologie [q-bio.TO]. Université Paul Sabatier - Toulouse III, 2021. Français. ⟨NNT : 2021TOU30162⟩. ⟨tel-03653778⟩
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