Oxydative stress and diabetes : Glycation impact on erythrocytes morphology, redox state and capacity to impact cultured vascular cell functionnalities
Stress oxydant et pathologie diabétique : impact de la glycation des érythrocytes sur leur morphologie, statut redox et capacité à moduler la fonctionnalité de cellules vasculaires humaines en culture.
Résumé
Diabetes constitutes an enhanced prevalent disease, associated with a dramatic mortality rate due to its vascular complications. Chronic hyperglycemia in diabetes leads to enhanced oxidative stress and glycation phenomena affecting circulating components. Despite erythrocytes represent determinant actors in vascular complications, very little is known about how glycation can affect their structures, capacities to be phagocytosed and impair endothelial cell functioning. The objective of my thesis was to evaluate the impact of glycation on erythrocytes characteristics and capacities to affect endothelial cell function following erythrophagocytosis. In vitro glycated erythrocytes were prepared in the absence or presence of increasing concentrations of glucose. To get insight into the in vivo relevance of our results, these data were compared to that of erythrocytes purified from diabetic or non-diabetic subjects. Oxidative damages and deformability capacities were measured on the different erythrocyte preparations by using dot blot techniques and ektacytometry, respectively. Protective effects of Antirhea borbonica (Ab) extracts against erythrocyte glycation damages were tested in vitro and in vivo by using zebrafish animals. Human umbilical vascular endothelial cells and EA.hy926 cell lines were incubated with glycated or nonglycated erythrocytes, previously labelled with fluorescent probes. Erythrophagocytosis together with reactive oxygen species (ROS) production, iron accumulation and cellular permeability were determined in endothelial cells. Artificial microvessels were created to test the effects of circulating glycated erythrocytes on endothelial cells in a dynamic incubation condition. Structure alteration, redox status and oxidative modifications were found to be enhanced in glycated erythrocytes after determination of their deformability, hemolysis sensibility, ROS production and eryptosis phenomenon. These modifications were associated with reduced antioxidant defence enzymatic activities in glycated erythrocytes. Most of these oxidative damages identified in in vitro glycated erythrocytes were retrieved on erythrocytes from diabetic patients. Ab extract was shown to significantly preserve erythrocytes from methylglyoxal (MGO)-induced damages in terms of restored membrane deformability, reduced oxidative stress and eryptosis phenomenon. Antioxidant capacities of Ab extract on erythrocytes were retrieved in vivo in zebrafish previously infused with MGO. Erythrophagocytosis by endothelial cells was found to be about 2 fold increased when incubated in the presence of glycated erythrocytes compared with non-glycated erythrocytes. In addition, higher iron accumulation, ROS production and enhanced endothelial cell permeability were evidenced in cells previously incubated in the presence of glycated erythrocytes. Experiments in flow conditions evidenced a significant impact of glycated erythrocytes at specific zones of our 3D artificial micro vessel, the bifurcation zone preferential to vascular complication occurrence. This work highlights the impact of glycation on erythrocyte structure and capacity to interact with endothelial cells and open doors to research perspectives. Enhanced phagocytosis of glycated erythrocytes may impact endothelial cell function with putative consequences on the development of diabetic vascular complications. Further experiments are highly needed to reach better mechanistic insights on glycated erythrocytes impact on endothelial cell functioning and contributing to the research of therapeutic strategies against vascular disorders in diabetes.
Le diabète, maladie de plus en plus prévalente, est associée à des complications vasculaires fortement augmentées et souvent mortelles. L’hyperglycémie chronique de la maladie induit la glycation de composés circulants dont les dommages, de type oxydatif, peuvent participer à l’altération des vaisseaux sanguins. Bien que les érythrocytes représentent les constituants majeurs du sang, peu de choses sont connues quant à l’impact de la glycation sur leur capacité à participer aux désordresvasculaires. L’objectif de mon travail de thèse a été de préciser l’impact de la glycation sur les caractéristiques morphologiques des érythrocytes et sur leur capacité à être phagocyté et altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales humaines en culture. Des érythrocytes humains ont été glyqués par incubation en présence de concentrations croissantes en glucose. Aussi, des érythrocytes glyqués « in vivo » ont été purifiés de patients diabétiques. Les dommages oxydatifs et les capacités de déformabilité de nos préparations ont été mesurés par des techniques de biochimie, de cytométrie et d’ektacytométrie. L’emploi du modèle poisson zèbre a permis d’appréhender l’effet in vivo d’extrait d’Antirhea borbonica (Ab) sur la glycation des érythrocytes. Des cellules endothéliales humaines de lignée (EA.hy926) et purifiées à partir de cordons ombilicaux (HUVEC) ont été utilisées. Des microvaisseaux artificiels ont été développés pour l’étude de l’impact en condition de flux, des érythrocytes glyqués. Les érythrocytes glyqués, in vitro ou purifiés de patients diabétiques, présentent une augmentation deleurs dommages oxydatifs, une réduction de leur capacité de déformabilité ainsi que de leurs défenses antioxydantes et une éryptose accrue. Ces dommages oxydatifs induits par la glycation des érythrocytes sont prévenus par des extraits d’Ab à la fois in vitro et in vivo dans le modèle animal poisson zèbre. Une phagocytose significativement augmentée a été observée dans les cellules endothéliales incubées avec des érythrocytes glyqués. Cette érythrophagocytose accrue s’accompagne d’une accumulation de fer, d’un stress oxydant accru et d’une augmentation de la perméabilité des cellules endothéliales incubées avec les érythrocytes glyqués. Nos expériences d’incubation des microvaisseaux avec les érythrocytes en condition dynamique a révélé leur impact significatif sur l’endothélium à des points spécifiques, les bifurcations, zones préférentielles de l’apparition de complications vasculaires. Les résultats de ma thèse apportent quelques éléments d’information nouveaux quant à l’implication des phénomènes de glycation sur les propriétés des érythrocytes et sur leur capacité à altérer la fonctionnalité de cellules endothéliales et offrent des pistes de perspectives de recherche mécanistique. Une meilleure compréhension de l’impact des phénomènes de glycation et de leurs conséquences tissulaires, ainsi que des moyens de les limiter, pourrait participer dans l’effort de recherche des stratégies thérapeutiques contre les désordres vasculaires de la personne diabétique.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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