Contribution of 2-photon microscopy for exploration of lung involvement after murine model infection with Influenzavirus
Apport de la microscopie 2-photon pour l'exploration des conséquences pulmonaires après infection d'un modèle murin par Influenzavirus
Résumé
Introduction. Influenza virus, responsible for deadly pandemics, was associated each winter with significant mortality despite vaccine and antiviral treatments. Inflammation seems to be therapeutic target requiring good understanding of its post-infection immune mechanisms. Studies evaluating innate immune reaction induced by Influenzavirus are based on quantitative or functional methods. The anatomical explorations have most often been absent or only integrating global vision on histological sections. In this context, the goal of this thesis was to study contribution of 2-photon microscopy (2PM) for the evaluation of pulmonary consequences after Influenzavirus infection of mice model according to several modalities: fixed lung, ex vivo and comparison of different viral strains. Methods. We infected C57BL6 transgenic CD11C+YFP mice with A/Puerto Ricco/8/34 H1N1 (PR8) for analysis on fixed lung compared to mock-infected mice. Several analyzes were performed: flow cytometry, cytokines concentration assays, and 2PM observation after staining with anti F4/80 antibody coupled with BV421. The adapted “Live Lung Slice” method without agarose has been chosen for ex vivo intravital microscopy to analyze its feasibility, the preservation of cellular viability and evaluation of cellular mobility. In order to explore several viral strains of Influenzavirus, we infected the same mice model with strain A/WSN/1933 H1N1 (WSN) and applied same techniques. To compare different viruses, we explored lungs of hamsters infected with SARS-Cov2 using the same methods. The data were compared to those obtained with PR8 virus. Results. On a fixed lung, 2PM provided complementary and additive data to flow cytometry and cytokine assay by observing bronchial and bronchiolar epithelium lesions, localization of infection initially at the bronchial and bronchiolar epithelium before diffusion later to alveolar epithelium. The addition of F4/80 staining coupled with BV421 made it possible to visualize recruitment and pulmonary diffusion of macrophages. In addition, interactions between macrophages and infected cells are observed by 3D reconstructions enabled by 2PM imaging of lung in depth. Ex vivo intravital 2PM without agarose demonstrated its feasibility and preservation of cellular viability. Thus making possible to demonstrate from D1 the covered distance and macrophages movement speed significantly greater than that of dendritic cells. WSN infection induced same results as PR8. On the other hand, after infection by SARS-Cov2, no epithelial lesions were observed in 2PM, virus was localized exclusively at the level of alveolar epithelium. Macrophages recruitment was very localized at infected site alternating with areas of healthy lung, at the difference of flu during which we observed pulmonary homogeneity of macrophage infiltration. Conclusion. M2P is superior to conventional histology and complementary to usual explorations by providing anatomical lesions, virological and cellular recruitment data essential for a better understanding of pulmonary consequences induced by Influenzavirus infection. The preservation of cellular viability confirms feasibility of ex vivo method of our adapted “Live Lung Slice” protocol without agarose. The amplification from D1 post-infection of dendritic cells mobility but especially of macrophages gives them increased availability to optimize their interactions with the infected cells. 2PM is also an excellent tool for comparing pulmonary consequences after infection with different viral strains. To conclude, 2PM appears essential for the anatomical exploration of structural consequences and innate immune reaction after infection by Influenzavirus. The prospects for its application seem important: studies of co-infections, bacterial or fungal superinfections, impact of therapeutic strategy.
Introduction. La grippe, responsable de pandémies mortelles, est aussi associée à une mortalité significative chaque hiver malgré un vaccin et des traitements antiviraux. L'inflammation peut être une cible thérapeutique nécessitant de bien en comprendre les mécanismes immuns. Les études évaluant la réaction immunitaire innée induite par Influenzavirus sont basées sur des méthodes quantitatives ou fonctionnelles. Les explorations anatomiques sont le plus souvent absentes ou n'intégrant qu'une vision globale sur coupes histologiques. La problématique de cette thèse a été d'étudier l'apport de la microscopie 2-photon (M2P) pour l'évaluation des conséquences pulmonaires après infection à Influenzavirus d'un modèle murin selon plusieurs modalités : sur poumon fixé, ex vivo et en comparant différentes souches virales. Méthodes. Pour l'analyse sur poumon fixé, nous avons infecté par A/Puerto Ricco/8/34 H1N1 (PR8) des souris C57BL6 transgéniques CD11C+YFP comparativement à des souris non infectées. Différentes analyses étaient effectuées : cytométrie en flux, dosages des cytokines, et observation en M2P après marquage par Ac anti F4/80 couplé au fluorochrome BV421. La méthode du « Live Lung Slice » a été modifiée sans agarose pour la microscopie intravitale ex vivo pour analyser sa faisabilité, la préservation de la viabilité cellulaire et l'évaluation de la mobilité cellulaire. Afin d'explorer plusieurs souches virales d'Influenzavirus, nous avons infecté le même modèle animal avec la souche A/WSN/1933 H1N1 (WSN) et appliqué les mêmes techniques. Pour comparer différents virus, nous avons exploré selon les mêmes modalités des poumons de hamsters infectés par SARS-Cov2. Les données ont été comparées à celles obtenues avec PR8. Résultats. Sur poumon fixé, M2P apporte des données complémentaires à la cytométrie en flux et au dosage des cytokines, par l'observation de lésions épithéliales bronchiques, de l'évolution de la localisation de l'infection. L'ajout du marquage F4/80 couplé au fluorochrome BV421 permet de visualiser le recrutement et la diffusion pulmonaire des macrophages. De plus, les interactions entre macrophages et cellules infectées sont observées par les reconstructions 3D permises par l'imagerie du poumon en profondeur. M2P intravitale ex vivo sans agarose démontre sa faisabilité et la préservation de la viabilité cellulaire mettant en évidence une mobilité accrue des macrophages significativement supérieures aux cellules dendritiques. L'infection par WSN induit les mêmes résultats que PR8. Par contre, après infection par SARS-Cov2, aucune lésion de l'épithélium bronchique n'est observée, le virus se localise exclusivement au niveau de l'épithélium alvéolaire et le recrutement macrophagique est localisé au site infecté alternant avec des zones de poumon sain, à la différence de la grippe durant laquelle on observe une homogénéité pulmonaire de l'infiltration macrophagique. Conclusion. M2P est bien supérieure à l'histologie conventionnelle et complémentaire aux explorations habituelles en apportant des données anatomiques lésionnelles, virologiques et recrutements cellulaires indispensables à la bonne compréhension des conséquences pulmonaires induites par Influenzavirus. La préservation de la viabilité cellulaire confirme la faisabilité de la méthode ex vivo de notre protocole de « Live Lung Slice » adapté. L'amplification de la mobilité des cellules dendritiques et des macrophages leur procure une disponibilité accrue pour optimiser leurs interactions avec les cellules infectées. M2P est également un excellent outil pour la comparaison des conséquences pulmonaires après infection par différentes souches virales. Au total, M2P semble indispensable par l'exploration anatomique des conséquences structurales et de la réaction immune innée après infection par Influenzavirus. Les perspectives de son application semblent immenses : études des co-infections, des surinfections, de l'impact de stratégie thérapeutique.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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