Coupling of chromatographic methods with mass spectrometry for the characterization of therapeutic proteins
Caractérisation de protéines thérapeutiques par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
Résumé
Therapeutic proteins play a determinant role in the treatment of rare pathologies such as cancers, hemophilia, or immunodeficiency, and are often the unique therapeutic alternative available. Proteins are complex molecules with up to four different levels of structure and can suffer from numerous modifications that must be characterized before injection to patients. Liquid chromatography and mass spectrometry are the gold standard methods for the structural characterization of proteins. This thesis presents the development of liquid chromatography methods coupled to mass spectrometry for the characterization of different types of therapeutic proteins. The first part of the results describes the development of reverse phase liquid chromatography methods coupled to mass spectrometry for the characterization of post-translational modifications of polyclonal antibodies, such as oxidation and glycation, and the evaluation of the integrity of monoclonal antibodies disulfide bonds. The second part presents the development of native mass spectrometry methods for the characterization of monoclonal antibodies and albumin isoforms by the coupling of ion exchange chromatographic methods to mass spectrometry. Finally, the structure / function relationship between a therapeutic protein and a receptor is evaluated by studying the impact of post-translational modifications of albumin on its interaction with the neonatal Fc receptor and the impact of lysine in the C-terminal position of a monoclonal antibody on its interaction with neonatal Fc and FcγRIII receptors.
Les protéines thérapeutiques occupent une place déterminante dans le traitement de pathologies graves tels les cancers, l'hémophilie ou les déficits immunitaires, et constituent souvent l'unique alternative thérapeutique disponible. La chromatographie liquide et la spectrométrie de masse constituent les méthodes de référence pour la caractérisation structurale des protéines. Cette thèse rassemble des travaux portant sur le développement de méthodes de chromatographie liquide couplées à la spectrométrie de masse pour la caractérisation de différents types de protéines thérapeutiques. La première partie des résultats décrit le développement de méthodes de chromatographie liquide de phase inverse couplées à la spectrométrie de masse pour la caractérisation de modifications post-traductionnelles d'anticorps polyclonaux, telles que l'oxydation et la glycation, et permettant l'évaluation de l'intégrité de ponts disulfures d'anticorps monoclonaux. La seconde partie présente le développement de méthodes de spectrométrie de masse native pour la caractérisation des isoformes d'anticorps monoclonaux et de l'albumine, notamment par le couplage de méthodes de chromatographie d'échanges d'ions à la spectrométrie de masse. En dernier lieu, la relation structure/fonction entre une protéine thérapeutique et un récepteur est évaluée par l'étude de l'impact des modifications post-traductionnelles de l'albumine sur son interaction au récepteur néo natal Fc et l'impact de la lysine en position C-terminale d'un anticorps monoclonal sur son interaction aux récepteurs néo natal Fc et FcγRIIIa.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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