Dimérisation oxydative de protéines via des pontages d'acides aminés aromatiques - TEL - Thèses en ligne Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2022

Oxidative dimerization of proteins via aromatic amino acids cross-links

Dimérisation oxydative de protéines via des pontages d'acides aminés aromatiques

Anouchka Gatin
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1178105
  • IdRef : 263976300

Résumé

Covalent protein cross-links involving aromatic amino acids has been associated with a numerous of biological processes, as well physiological as pathological. Bi-tyrosine, used as a biomarker of protein oxidation is a typical example: it has been evidenced in a large number if isolated proteins, tissues and biological fluids. In the context of this study, covalent dimerization via aromatic amino acids will be studied through oxidation of i) isolated proteins, peptides and free amino acids in solution, ii) a protein complex made of human centrin 2 (CEN2) and Xeroderma Pigmentosum group C protein (XPC), then of iii) breast cancer human cells. Oxidative radicals' formation, as hydroxyl (•OH) and azide (N3•) radicals will be mediated by irradiation of protein samples in aqueous solution with gamma rays. Radio-induced covalent cross-links will be mainly examined by ultra performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS). A new analytic methodology based on isotopic labelling and H/D exchanges has been developed in order to precisely determine the chemical nature of the cross-links. First, tyrosine dimerization study at the amino acid scale allowed to highlight the formation of at least four different bi-tyrosine isomers. The applied analytical approach allowed to identify a new dimers family. These latter result from intramolecular Michael cycloaddition reactions and involve the para position of the tyrosyl radical from which dimerization originated. In the second part, dimers structural plurality has been confirmed at the protein scale. Co-existence of plentiful Michael additions' intermediates and final products has been underlined in particular via ion mobility spectrometry (IMS) experiments. While the considered protein possesses also tryptophan residues, tyrosine-tyrosine, tyrosine-tryptophan and tryptophane-tryptophane cross-links were evidenced. Third, oxidative dimerization behaviour of protein complexes composed of CEN2 and two XPC fragments of different size has been studied. It allowed to evidence for the first time the formation of covalent interprotein cross-links between both partners. In function of the amino acid sequence of the considered XPC fragment (presence or not of tyrosine), the cross-link nature differs: tyrosine-tyrosine or tyrosine-tryptophan. However, whatever the nature of the covalent bridges, both partners covalently bind throughout an oxidative attack. In the context of plural tyrosine-tryptophan cross-links formation, a detailed analysis of the chemical bonds nature has been completed at the amino acid scale. It brought to propose new types of tyrosine-tryptophan bridges. Finally, in-cellulo approach of CEN2 covalent cross-links detection when exposed to oxidative radicals has been engaged. The conditions of endogenous CEN2 detection and of its potential dimers have been developed by Western-Blot. Cellular extracts enrichment steps by immunoprecipitation and ammonium sulfate precipitation were realized. These preliminary experiments pave the way of the future investigation of in-cellulo covalents cross-links.
La formation de pontages protéiques covalents impliquant des acides aminés aromatiques (tyrosine, tryptophane) a été associée à de nombreux processus biologiques aussi bien physiologiques que pathologiques. La bi-tyrosine, utilisée comme biomarqueur de l'oxydation protéique en est l'exemple type: elle a été mise en évidence dans des nombreuses protéines isolées, tissus et fluides biologiques. Dans le cadre de cette thèse, l'étude de la dimérisation covalente via des acides aminés aromatiques sera abordée à travers l'oxydation i) de protéines isolées, de peptides et d'acides aminés libres en solution, ii) d'un complexe protéique formé de la centrine 2 humaine (CEN2) et de la protéine Xeroderma Pigmentosum (XPC) puis iii) de cellules humaines de cancer du sein. La formation de radicaux oxydants, comme le radical hydroxyle (•OH) et le radical azoture (N3•) sera médiée par l'irradiation des échantillons protéiques en solution aqueuse sous rayonnement gamma. La formation des pontages covalents induits sous oxydation radiolytique sera principalement analysée par chromatographie liquide ultra performance couplée à la spectrométrie de masse (UPLC-MS). Une nouvelle méthodologie analytique basée sur le marquage isotopique et les échanges H/D a été développée pour déterminer la nature des liaisons chimiques en étant à l'origine. Dans un premier temps, l'étude de la dimérisation de la tyrosine à l'échelle de l'acide aminé isolé a permis de mettre en évidence la formation d'au moins quatre isomères de bi-tyrosine. La démarche d'analyse mise en place a permis d'identifier une nouvelle famille de dimères de tyrosine. Ces derniers résultent de réactions de cycloaddition de Michael intramoléculaires et impliquent la position para du radical tyrosyle à l'origine de la dimérisation. Dans un second temps, la pluralité structurale des dimères a été confirmée à l'échelle protéique. La coexistence de nombreux intermédiaires et produits finaux d'additions de Michael a été soulignée, notamment via des expériences de spectrométrie de mobilité ionique (IMS). Tandis que la protéine considérée possède aussi des résidus tryptophane, des pontages tyrosine-tyrosine, tyrosine-tryptophane et tryptophane-tryptophane ont été détectés. En troisième lieu, le comportement oxydatif de dimérisation de complexes protéiques formés de la CEN2 et de deux fragments de taille différente de la XPC a par la suite été étudié. Il a permis de mettre en évidence pour la première fois la formation de pontages covalents interprotéiques entre les deux partenaires. En fonction de la séquence en acides aminés du fragment considéré de la XPC (présence ou non d'un résidu tyrosine), la nature des liens covalents diffère : tyrosine-tyrosine ou tyrosine-tryptophane. Toutefois, quelle que soit la nature des pontages formés, les deux partenaires protéiques se lient de manière covalente lors d'une attaque oxydative. Dans le cadre de la formation de pluriels pontages tyrosine-tryptophane, une analyse détaillée de la nature des liaisons chimiques en étant à l'origine a été menée à l'échelle des acides aminés isolés et a amené à proposer de nouveaux types de pontage. Enfin, une approche in-cellulo de détection de pontages covalents de la CEN2 formés lors de l'exposition à des radicaux oxydants a été entreprise. Les conditions de détection de la CEN2 endogène et de ses potentiels dimères ont été mises au point par Western-Blot. L'enrichissement en CEN2 des extraits cellulaires par immunoprécipitation et précipitation au sulfate d'ammonium a également été réalisé. Ces expériences préliminaires ouvrent la voie à l'investigation future de pontages covalents formés in-cellulo.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-03826857 , version 1 (24-10-2022)

Identifiants

  • HAL Id : tel-03826857 , version 1

Citer

Anouchka Gatin. Dimérisation oxydative de protéines via des pontages d'acides aminés aromatiques. Chimie analytique. Université Paris-Saclay, 2022. Français. ⟨NNT : 2022UPASF051⟩. ⟨tel-03826857⟩
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