Characterization of the viral replicase of hepatitis E virus
Caractérisation de la réplicase du virus de l'hépatite E
Résumé
Hepatitis E virus (HEV) is the major cause of acute hepatitis worldwide. Currently,no effective anti-viral treatment against HEV is available and an HEV vaccine is restrictedto China. HEV is a positive-sense RNA virus expressing 3 open readingframes (ORFs). ORF1 encodes the ORF1 non-structural polyprotein, the viral replicasewhich transcribes the full—length genome and a subgenomic RNA that encodesthe structural ORF2 and ORF3 proteins. Our aim is to better characterize ORF1 :to determine whether it is processed during the HEV lifecycle and to identify thecompartment of replication. As no commercial antibody recognizes ORF1 in HEVreplicatingcells, we aimed at inserting epitope tags within the ORF1 sequence of thecell—culture selected genotype 3 p6 strain. First, a HEV replicon where the Gaussialuciferase reporter gene lies under the control of ORF1 was used to assess the replicationefficacy of the tagged genome by luminometry. The insertion of the 2 V5 tagsin the hypervariable région did not significantly impact the replication of genomic andproduction of subgenomic RNA, whereas the insertion of an HA tag at the C-terminusof the RNA-dependent RNA polymerase reduced the production of subgenomic RNA.Tags were next inserted both into the infectious full—length p6 HEV genome and intoORF1 heterologously expressed. Western-blot and immunoprecipitation analyses oftagged ORF1 expressed in the 3 systems showed a high molecular weight protein(>180kDa) that likely corresponds to the unprocessed form of ORF1 and that canbe detected up to 25 days after electroporation of the p6 infectious RNA in PLC3cells. Additionally, lower molecular weight proteins (90-180kDa) were detected inlower abundance, suggesting that ORF1 might be processed. Mass spectrometryanalyses were performed to identify the sequence of the potential cleavage productsobserved by western blot and colloidal blue staining. It appears that the N-terminusof ail V5-tagged proteins of lower molecular weight is stable and corresponds to theN-terminus of the full length ORF1 protein. However, the C-terminus was not yetidentified. Interestingly, western blot analysis of subcellular fractions as well as confocalmicroscopy revealed cytoplasmic and nuclear localization of the tagged ORF1,indicating that the ORF1 might pass through the nucleus during infection.Finally, we used the RNAscope technique to visualize the intracellular HEV RNA.Probes were designed against positive and negative-stranded HEV RNA. Genomicand subgenomic RNA were found in close proximity to each other and to viral proteinsin perinuclear substructures that may correspond to replication complexes.
Le virus de l'hépatite E (VHE) est la principale cause d'hépatite aiguë dans le monde. Actuellement, aucun traitement antiviral efficace contre le VHE n'est disponible et un vaccin contre le VHE n'est disponible qu'en Chine. Le VHE est un virus à ARN simple brin de polarité positive exprimant 3 cadres de lecture ouverts (ORF). L'ORFI code pour la polyprotéine non structurale ORF1, ou réplicase virale, qui transcrit le génome complet et un A RN sous-génomique qui code pour les protéines structurales ORF2 et ORF3. Notre objectif est de mieux caractériser l'ORFI : déterminer si cette protéine subit une maturation au cours du cycle viral et identifier le compartiment de réplication du VHE.Comme aucun anticorps commercial ne reconnaît l'ORFI en système réplicatif, nous avons cherché à insérer des épitopes dans la séquence ORF1 de la souche p6 de génotype 3 qui a été sélectionnée en culture cellulaire.Tout d'abord, un réplicon du VHE où le gène rapporteur Gaussia luciférase se trouve sous le contrôle de l'ORFI a été utilisé pour évaluer l'efficacité de réplication du génome étiqueté. L'insertion de 2 étiquettes V5 dans la région hypervariable n'a paseu d'impact significatif ni sur la réplication du génome ni sur la production d'ARNsous-génomique, alors que l'insertion d'un épitope HA à l'extrémité C-terminale de l'ARN polymérase ARN-dépendante a réduit la production d'ARN sous-génomique.Des étiquettes ont ensuite été insérées à la fois dans le génome infectieux p6 HEV complet et dans l'ORFI exprimée de manière hétérologue. Des analyses en Westernblot et par immunoprécipitation de l'ORFI étiquetée et exprimée dans les 3 systèmes ont révélé la présence d'une protéine de poids moléculaire élevé (>180kDa) qui correspond probablement à la forme ORF1 de pleine longueur. Celle-ci a pu être détectée jusqu'à 25 jours après électroporation de l'ARN infectieux p6 dans les cellulesPLC3.En outre, les protéines de poids moléculaires inférieurs (90-180kDa) ont été détectées en plus faible abondance, ce qui suggère que l'ORFI est clivée. Des analyses par spectrométrie de masse ont été réalisées pour identifier la séquence des produits de clivage potentiels. Il apparaît que l'extrémité N-terminale de toutes les protéines étiquetées V5 de faible poids moléculaire est stable et correspond à l'extrémité N -terminale de la protéine entière.Cependant, l'extrémité C-terminale n'a pas encore été identifiée. De façon intéressante,l'analyse par western blot des fractions subcellulaires ainsi que la microscopie confocale ont révélé une localisation cytoplasmique et nucléaire de l'ORFI étiquetée,indiquant que l'ORFI pourrait être transloquée dans le noyau pendant l'infection.Enfin, nous avons utilisé la technique RNA scope pour localiser l'ARN du VHE à l'intérieur de la cellule hôte. Les sondes ont été conçues pour s'hybrider spécifiquement aux brins positif et négatif de l'ARN du VHE. L'ARN génomique et subgénomique ont été localisés à proximité les uns des autres ainsi que des protéines virales dans des structures périnucléaires qui pourraient représenter les complexes de réplication du VHE.
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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