Investigation of fluorinated peptides as a new class of domain-specific ligands for the Peptidyl-Prolyl isomerase Pin1
Étude des peptides fluorés comme nouvelle classe de ligands spécifiques de domaines pour la Peptidyl-Prolyl isomérase Pin1
Résumé
Pin1 is a peptidyl-prolyl cis/trans isomerase specific for phosphorylated Ser/Thr-Pro (pS/T-P) motifs. Structurally, Pin1 is a relative small multidomain protein (18.2 kDa) composed of a PPIase catalytic domain (with preference to the substrates in cis conformation) and a WW domain (with preference to the substrates in trans conformation) that are connected by a flexible linker loop region. Previous studies showed that binding of phosphopeptide substrates to Pin1 WW domain could alter Pin1 inter-domain contacts, strengthening or weakening it depending on the substrate sequence. Thus, changes in inter-domain contacts may act as a trigger in the Pin1 mechanism. In cells, Pin1 plays a crucial role in numerous signaling pathways: it regulates the outcome of the proline-directed kinase signaling and consequently controls cell proliferation and survival. Importantly, Pin1 dysregulation can lead to a number of human diseases, including cancer and neurological disorders such as Alzheimer’s disease. Pin1 has thus become a promising drug target and the development of potent Pin1 inhibitors has been an attractive topic. However, so far, the identified Pin1 peptide inhibitors lack specificity, cell permeability and/or stability. In this project, we took advantage of the overall properties imparted by the fluorine atoms for the developpement of fluorinated peptides as a new class of Pin1 ligands. We have considered the fluorination of ligands at the C position of pseudoproline residues to lower the rotational barrier of the cis-trans peptide bond isomerization and enhance the cis:trans population ratio. The interaction of tens of fluorinated (or not) ligands with FL Pin1 and the isolated PPIase and WW domains were deeply studied by NMR titrations. We showed the ability of fluorinated peptides, mainly adopting the cis conformation, to bind selectively to the PPIase domain. In a second step, we decided to take advantage of the domain binding preferences of our ligands to gain insight into the activity mechanism of Pin1. For this purpose, NMR relaxation experiments were performed in the presence of different ligands. In addition, biological assays, using fluorometric coupled tests and EXSY NMR measurements were carried out. We showed that one subset of WW ligands was able to reduce the overall dynamics of the Pin1 protein, while a second subset increased it. A similar classification can be made for the PPIase ligands. Interestingly, an allosteric mechanism was demonstrated where modification of Pin1 protein dynamics by ligation of a WW ligand correlated with an increase in affinity for the first subset of the PPIase domain ligands, while the affinity of the second subset was decreased. In this regard, our results established that the WW domain can provide a targeting role for PPIase activity, as Pin1 has more than 80 protein partners identified to date. Another part of my work explored the oligomerization properties of the Pin1 protein in solution. Based on several crystallographic structures of Pin1 which present a dimer in their asymmetric units and MD simulations to assess the stability of the dimer with or without ligands, we decided to test whether the dimeric form of Pin1 remained present in solution. For this purpose, three different techniques have been employed, DLS, DOSY and relaxation experiments by NMR. Interestingly, at concentration higher than 1 mM, results revealed the presence of oligomeric forms of Pin1 in solution. Additional data are still needed to confirm this result and evaluate its implication on the Pin1 catalytic mechanism.
Pin1 est une peptidyl-prolyl cis/trans isomérase spécifique des motifs Ser/Thr-Pro (pS/T-P) phosphorylés. Pin1 est une protéine relativement petite (18,2 kDa) composée d'un domaine catalytique PPIase (avec une préférence pour les substrats en conformation cis) et d'un domaine WW (avec une préférence pour les substrats en conformation trans) qui sont reliés par une bras flexible. Des études antérieures ont montré que la liaison de substrats phosphopeptidiques au domaine WW pouvait modifier les contacts inter-domaines de Pin1, en les renforçant ou les affaiblissant selon la séquence du substrat. Ainsi, les changements dans les contacts inter-domaines peuvent agir comme un modulateur du mécanisme catalytique de Pin1.Dans les cellules, Pin1 joue un rôle crucial dans de nombreuses voies de signalisation : elle régule l'issue de la signalisation des kinases dirigées par la proline et, par conséquent, contrôle la prolifération et la survie des cellules. Il est important de noter que la dérégulation de Pin1 peut conduire à un certain nombre de maladies humaines, y compris le cancer et les troubles neurologiques tels que la maladie d'Alzheimer. Pin1 est donc devenue une cible thérapeutique prometteuse et le développement d'inhibiteurs puissants de Pin1 est un sujet qui intéresse de nombreux chercheurs. Cependant, jusqu'à présent, les inhibiteurs peptidiques de Pin1 identifiés manquent de spécificité, de perméabilité cellulaire et/ou de stabilité. Dans ce projet, nous avons choisi de profiter des propriétés particulières conférées par les atomes de fluor pour développer des peptides fluorés comme nouvelle classe d'inhibiteurs de Pin1. Nous avons tenté d’incorporer le groupe CF3 sur la position C d’acides aminés pseudoproline afin d’abaisser la barrière d’énergie de l'isomérisation de la liaison peptidique cis-trans et d’augmenter le rapport de population cis:trans. L'interaction de dizaines de ligands fluorés (ou non) avec FL Pin1 et ses domaines PPIase et WW isolés a été étudiée en profondeur par RMN. Nous avons montré la capacité des peptides fluorés, adoptant majoritairement une conformation cis, à se lier sélectivement au domaine PPIase. Dans un deuxième temps, nous avons décidé de profiter de la selectivité de nos ligands envers un domaine particulier pour mieux comprendre le mécanisme d'activité catalytique de Pin1. Dans ce but, des expériences de relaxation par RMN ont été réalisées en présence de différents ligands. De plus, des tests biologiques, utilisant des tests fluorimétriques et des mesures RMN EXSY ont été réalisés. Nous avons montré qu'un sous-ensemble de ligands WW était capable de réduire la dynamique globale de la protéine Pin1, tandis qu'un second sous-ensemble l'augmentait. Une classification similaire a pu être faite pour les ligands du domaine PPIase. De façon intéressante, un mécanisme allostérique a été démontré où la modification de la dynamique de la protéine Pin1 par la ligation d'un ligand WW est corrélée à une augmentation de l'affinité pour le premier sous-ensemble de ligands du domaine PPIase, alors que l'affinité du second sous-ensemble est diminuée. À cet égard, nos résultats établissent que le domaine WW peut jouer un rôle de ciblage pour l'activité PPIase, car Pin1 a plus de 80 partenaires protéiques identifiés à ce jour. Une autre partie de mon travail a consisté à explorer les propriétés d'oligomérisation de la protéine Pin1 en solution. Sur la base de plusieurs structures cristallographiques de Pin1 qui présentent un dimère dans leur unité asymétrique et de simulations MD pour évaluer la stabilité du dimère avec ou sans ligands, nous avons décidé de tester si la forme dimérique de Pin1 reste présente ou non en solution. A cette fin, trois techniques différentes ont été employées, la DLS, des expériences DOSY et des mesures de relaxation par RMN. De manière intéressante, à une concentration supérieure à 1 mM, nos résultats ont révélé la présence de formes oligomériques de Pin1 en solution [...]
| Origine | Version validée par le jury (STAR) |
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