Structural and functional studies of a human potassium channel, Kir2.1. Mechanism and consequences of mutations
Études structurale et fonctionnelle d'un canal à potassium humain, Kir2.1. Mécanisme et conséquences des mutations
Résumé
The ability of a cell to facilitate the selective and rapid movement of ions and small molecules across the plasma membrane is one of the most fundamental biological processes. Inward rectifier potassium (Kir) channels are integral membrane proteins that provide K+-selective pathways across the otherwise impermeable cell membrane along the electrochemical gradients. Kir channels support the flow of K+ ions into and out of the cell and regulate various functions in the human body, including heart rate, vascular tone, insulin secretion, and salt and fluid balance. The physiological significance of Kir channels is highlighted by the fact that genetically-inherited defects in these genes result in human diseases (channelopathies). We are particularly interested in Andersen’s syndrome, where mutations in the KCNJ2 gene coding for Kir2.1 protein are directly involved. Andersen’s syndrome (AS) is a rare disease characterized by cardiac arrhythmias, dysmorphic features, and periodic paralysis. The available treatment for AS patients is empirical rather than rational due to the lack of knowledge of this Kir2.1 channel. This thesis aimed to identify the differences between the wild-type Kir2.1 channel and two mutant AS-causing channels to find links between the structure and the function of human Kir2.1 using a combination of biochemical, structural, and functional approaches. In this study, we recombinantly expressed the human Kir2.1 channel in yeast and purified it in detergent. We characterized the interaction between Kir2.1 and the essential activator PIP2, solved the first human Kir channel structure by cryo-EM, and explored reconstitution in detergent-free systems like amphipols and nanodiscs. The findings of this study will provide a structural and functional base to understand better the mechanisms involved in Kir channels and the effects of their mutations. This manuscript is divided into three parts. The first part introduces Kir channels and state-of-the-art. The second part focuses on the characterization of the human potassium channel Kir2.1, the determination of its structure by cryo-EM, and the impact of mutations on its structure and function. The third part presents two mutations in the bacterial homolog KirBac3.1, which shares structural features with Kir2.1, to provide insight into the gating mechanism of Kir channels.
La capacité d'une cellule à faciliter le mouvement sélectif et rapide des ions et des petites molécules à travers la membrane plasmique est un processus biologique indispensable. Les canaux potassiques à rectification entrante (Kir) sont des protéines membranaires intégrales qui fournissent des voies sélectives aux ions K+ à travers la membrane cellulaire autrement imperméable, le long des gradients électrochimiques. Les canaux Kir permettent le passage des ions K+ dans les deux sens et régulent diverses fonctions chez les humains, notamment la fréquence cardiaque, le tonus vasculaire, la sécrétion d'insuline et l'équilibre salin et hydrique. L'importance physiologique des canaux Kir est mise en évidence par le fait que des défauts génétiquement héréditaires de ces gènes entraînent des maladies humaines (canalopathies). Nous nous intéressons particulièrement au syndrome d'Andersen, où des mutations du gène KCNJ2 codant pour la protéine Kir2.1 sont directement impliquées. Le syndrome d'Andersen (AS) est une maladie rare caractérisée par des arythmies cardiaques, des dysmorphies multiples et des paralysies périodiques. Le traitement disponible pour les patients atteints d’AS est empirique plutôt que rationnel en raison de la manque de connaissance de ce canal Kir2.1. Cette thèse visait à identifier les différences entre le canal Kir2.1 de type sauvage et deux canaux mutants causant l’AS afin de trouver des liens entre la structure et la fonction du Kir2.1 humain en utilisant une combinaison d'approches biochimiques, structurelles et fonctionnelles. Dans cette étude, nous avons exprimé le canal Kir2.1 humain dans la levure et l'avons purifié dans un détergent. Nous avons caractérisé l'interaction entre Kir2.1 et l'activateur essentiel PIP2, résolu par cryo-EM la première structure d'un canal Kir humain et exploré la reconstitution dans des systèmes modèles sans détergent comme les amphipols et les nanodisques. Les résultats de cette étude fourniront une base structurale et fonctionnelle pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans les canaux Kir et les effets de leurs mutations. Ce manuscrit est divisé en trois parties. La première partie présente les canaux Kir et l'état de l'art. La deuxième partie porte sur la caractérisation du canal potassique humain Kir2.1, la détermination de sa structure par cryo-EM et l'impact des mutations sur sa structure et sa fonction. La troisième partie présente deux mutations dans l'homologue bactérien KirBac3.1, qui partage des caractéristiques structurelles avec Kir2.1, pour donner un aperçu du mécanisme d’ouverture et fermeture des canaux Kir.
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